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qiusiqi銀蟲 (初入文壇)
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[交流]
cas9靶位點(diǎn)基因退火 已有3人參與
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最近在做cas9，靶位點(diǎn)20bp基因退火然后做大腸桿菌轉(zhuǎn)化，一直轉(zhuǎn)化不成功，求各位指點(diǎn)一下。用的一下程序。 退火：F位點(diǎn)序列2ul ， R位點(diǎn)序列 2ul ，tap buffer2ul ，dd水14ul。94℃10min冷卻至室溫。 質(zhì)粒酶切：BsaI酶1ul，buffer5ul，質(zhì)粒10ul，dd水34ul。37℃60min。然后65℃熱失活20min。 5段磷酸化：退火產(chǎn)物5ul，T4PNK酶1ul，10xbuffer2ul，dd水12ul。37℃30min T4連接酶鏈接:靶位點(diǎn)dna3ul，載體1ul，T4酶0.5ul，buffer2ul，dd水3.5ul。25℃90min。 用以上步驟總是連接不上，不知哪里出了問題。求各位指點(diǎn)。。。。 |
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kangaroo0513
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http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=10321749&authorid=2621902 上次我就和你說(shuō)去看我回復(fù)別人的帖子。。然后又看到你再問。。 |
2樓2016-06-03 22:49:46
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可以把引物F和R同時(shí)進(jìn)行pnk磷酸化（添加有ATP），再用沸水煮5分鐘，待其在隨沸水自然冷卻復(fù)性，以后連接載體。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-06-03 23:25:43
qiusiqi
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4樓2016-06-04 09:02:04
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5樓2016-06-04 09:02:37
qiusiqi
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6樓2016-06-04 09:03:40
7樓2016-08-14 12:19:00
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