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CarolChan新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
構(gòu)建的重組菌無(wú)法誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白 已有1人參與
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求助各位一個(gè)關(guān)于蛋白表達(dá)的問(wèn)題。 我有一個(gè)900bp的基因，最先是和pET28a連接，導(dǎo)進(jìn)BL21(DE3)，一開(kāi)始是表達(dá)的，但是純化之后發(fā)現(xiàn)有背景蛋白，即沒(méi)有誘導(dǎo)的菌也能表達(dá)出一個(gè)和目的片段大小相等的蛋白，但是是沒(méi)有酶活的，而誘導(dǎo)后的蛋白是有酶活的。 后來(lái)為了去掉背景蛋白，我把這個(gè)片段和pMAL-C2X連接，導(dǎo)進(jìn)TB1中，結(jié)果不表達(dá)了，也純化不出任何蛋白。 于是我懷疑是pMAL-C2X這個(gè)載體有問(wèn)題，就從一個(gè)先前構(gòu)建可以表達(dá)的pMAL-C2X-X重組質(zhì)粒中，把X去掉，把我的基因連接上去。結(jié)果還是不表達(dá)。 然后我又換了Transetta宿主，能誘導(dǎo)出一個(gè)MBP標(biāo)簽大小的蛋白，但是這個(gè)蛋白比目的蛋白小了很多，而且測(cè)序結(jié)果顯示，這其中是不含突變和移碼的。 后來(lái)我又把之前構(gòu)建的pET28a-基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)進(jìn)Transetta宿主菌中。結(jié)果純化出的也是比目的蛋白小的蛋白。。。 我現(xiàn)在已經(jīng)試過(guò)改變各種誘導(dǎo)條件，比如誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG濃度等等，但都沒(méi)有顯著的影響。 最后放一張我誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果圖（以重組菌TB1/C2X-目的基因?yàn)槔�，懇求大家給我出出主意，萬(wàn)分感激。 P.S：line1：marker；line2：誘導(dǎo)前；line3：誘導(dǎo)后，圖中其實(shí)還有l(wèi)ine4，就是純化的結(jié)果，只是沒(méi)有任何條帶... 捕獲.JPG |
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2樓2016-06-13 15:27:30
CarolChan
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5樓2016-06-14 09:36:06
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7樓2016-06-14 15:19:24
睡夢(mèng)中的雄獅
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8樓2016-06-15 21:54:35
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沒(méi)有表達(dá)。你用BL21已經(jīng)表達(dá)出來(lái)了，還換系統(tǒng)干嘛。雖然說(shuō)DE3系列的菌本底表達(dá)量很少，但也不能排除沒(méi)有的情況。建議你用標(biāo)簽抗體做WB，就能確定是不是目的蛋白，以及蛋白表達(dá)量的大概值了。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
9樓2016-06-16 08:54:11
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10樓2016-06-28 11:01:14
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