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冥王星兔子鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
敲減目的基因卻影響了另一個(gè)基因的表達(dá)/敲減目的基因的效率隨著傳代變差
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各位好： 我 最近買了慢病毒來敲減一種基因，但是最后發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照有問題。雖說我要敲減的目的基因在陰性對(duì)照內(nèi)與wildtype并無差別，但是另一種我要研究的基因卻只有wildtype的0.3，這樣的影響是不能接受的。所以我想知道這可能是什么原因。 另一個(gè)問題是，我敲減的慢病毒序列，起初是有效的，但是后來發(fā)現(xiàn)敲減的效率變差了，也就是PCR做出來基因表達(dá)沒有剛開始敲減后那么低了。我是一直保持10ug/ml的嘌呤霉素篩選濃度的，嘌呤霉素也沒有問題，對(duì)于wildtype的細(xì)胞48h內(nèi)可以全部殺死。 這兩個(gè)問題實(shí)在是困擾我很久。這兩個(gè)問題導(dǎo)致我完全無法繼續(xù)試驗(yàn)，因?yàn)闆]有陰性對(duì)照，而且就算找公司另行合成，我也沒有底氣新的陰性對(duì)照就沒有問題。對(duì)于第二個(gè)問題，我則是不知道是要重新用慢病毒來敲減還是重新合成比較好，亦或是當(dāng)初我轉(zhuǎn)染的時(shí)候出現(xiàn)了操作失誤。 在這里附上我當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)染的操作： 1、細(xì)胞點(diǎn)六孔板。使之隔夜貼壁，匯合率大概30-50%。 2、棄舊培養(yǎng)基，換1ml新鮮完全培養(yǎng)金，并且加病毒液 30ul，polybrene 5ul。4小時(shí)后補(bǔ)加1ml完全培養(yǎng)基。24h后發(fā)現(xiàn)有綠色熒光（慢病毒帶有綠色熒光序列）。48h后熒光幾乎布滿整個(gè)視野。 3、傳代到一個(gè)小皿。隔夜貼壁，細(xì)胞大概在50-60%，此時(shí)換液，加嘌呤霉素10ug/ml。24h后幾乎沒有飄起死亡的細(xì)胞。 4、維持嘌呤霉素10ug/ml濃度，正常培養(yǎng)，傳代和實(shí)驗(yàn)。 如果有誰有這方面的經(jīng)驗(yàn)，或者建議，請(qǐng)不吝賜教。 |
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