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蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化實(shí)驗(yàn) 已有4人參與
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蛋白質(zhì)表達(dá)、分離、純化可以： （1）探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理； （2）供作結(jié)構(gòu)與功能的研究； （3）作為催化劑、營(yíng)養(yǎng)劑等。 實(shí)驗(yàn)方法原理：攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過(guò)共價(jià)偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實(shí)為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析 實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌BL21 試劑、試劑盒：LB液體培養(yǎng)基、 氨芐青霉素、 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 、蒸餾水 、胰蛋白胨 、酵母粉、 氯化鈉 儀器、耗材：搖床 、離心機(jī)、 層析柱、 離心管、 移液槍、 槍頭盒 實(shí)驗(yàn)步驟 一、試劑準(zhǔn)備 1. LB液體培養(yǎng)基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸餾水配至1000 mL。 2. 氨芐青霉素：100 mg/mL。 3. 上樣緩沖液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。 4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。 5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。 6. IPTG：100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。 二、獲得目的基因 1. 通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。 2. 通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。 三、構(gòu)建重組表達(dá)載體 1. 載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。 2. PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。 四、獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種 1. 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。 2. 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。 3. 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。 五、氯霉素�；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo) 1. 接種含有重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含100 ug/mL 氨芐青霉素），37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 2. 按1∶50或1：100的比例稀釋過(guò)夜菌，一般轉(zhuǎn)接1 mL過(guò)夜培養(yǎng)物于100 mL（含100 ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大約需3 h）。取10 ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。 3. 對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h。 4. 12 000 rpm 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。 六、氯霉素�；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化 1. NTA層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入1 mL NTA介質(zhì)，并分別用8 mL 去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。 2. 重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。 3. 上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。 4. 洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01分步收集洗脫液，約3-4 h，取10 ul洗脫開(kāi)始時(shí)的樣品用于SDS-PAGE 分析。 5. 洗脫目標(biāo)蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級(jí)分，分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。 注意事項(xiàng) 1. 選擇表達(dá)載體時(shí)，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。 2. 融合表達(dá)時(shí)在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過(guò)程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。 3. 菌液OD值要小于1，否則細(xì)胞太濃太老，不易破碎，且質(zhì)粒易丟失。 4. 誘導(dǎo)時(shí)間最好做一個(gè)梯度，不同蛋白誘導(dǎo)時(shí)間需摸索。 5. 誘導(dǎo)溫度適當(dāng)摸索：25、30℃。 6. IPTG濃度：一般在1 mM 以內(nèi)，可適當(dāng)摸索。 7. 超聲條件可視實(shí)際情況改變，只要使菌體裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。 |
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 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 | 表達(dá)載體的選擇及改造 |
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