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各種轉(zhuǎn)染試劑的中文轉(zhuǎn)染方法 已有1人參與
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FuGENE6（Roche）轉(zhuǎn)染步驟： 轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分至培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)50-80％融合。將細(xì)胞以1-3×105/2 ml接種于6孔板后孵育過夜將達(dá)到如此密度。 將FuGENE6 Reagent在室溫孵育10-15分鐘。使用之前將FuGENE6顛倒混勻一下。 1.在PCR管中加入不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液以稀釋FuGENE6，直至總體積到100 ul。 2.將3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入營(yíng)養(yǎng)液，輕彈管壁混合。 3.加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），輕彈管壁混合。 4.室溫孵育20分鐘。 5.將6孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，加入約1 ml不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液洗滌一次，再加入2 ml不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液。 6.將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞，混勻使之均勻分布。 7.3-8小時(shí)后，加入血清或換成含血清的營(yíng)養(yǎng)液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染步驟（6孔板）： 1.轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90-95％。細(xì)胞鋪板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。 2.對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250 ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM I培養(yǎng)基）稀釋4.0 ugDNA，輕輕混勻。 3.使用前將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用250 ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM I培養(yǎng)基）稀釋10 ul Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine 2000稀釋后，在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合（<30分鐘）。 NOTE：若使用DMEM培養(yǎng)基，則需在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。 4.混合稀釋的DNA（第二步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第三步）。室溫放置20分鐘。 5.（optional）將6孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入2 ml無(wú)血清配養(yǎng)基。 6.直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。 7.在37℃，5％CO2中保溫24-48小時(shí)。無(wú)需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基。 或者在4-5小時(shí)后更換培養(yǎng)生長(zhǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。 8.在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。 貼壁細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染： 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞以≥1:10的比例傳代至新鮮培養(yǎng)基中，次日加入選擇性培養(yǎng)基。 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染步驟（24孔板）： 1.轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（0.5-2×105），細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90-95％。細(xì)胞鋪板在0.5 ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。 2.對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50 ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM I培養(yǎng)基）稀釋0.8-1.0 ugDNA，輕輕混勻。 3.使用前將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用50ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM I培養(yǎng)基）稀釋1-3 ul Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine 2000稀釋后，在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合（<30分鐘）。 NOTE：若使用DMEM培養(yǎng)基，則需在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。 4.混合稀釋的DNA（第二步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第三步）。室溫放置20分鐘。 5.（optional）將24孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入0.5ml無(wú)血清配養(yǎng)基。 6.直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。 7.在37℃，5％CO2中保溫24-48小時(shí)。無(wú)需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基。 或者在4-5小時(shí)后更換培養(yǎng)生長(zhǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。 8.在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。 貼壁細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染： 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞以≥1:10的比例傳代至新鮮培養(yǎng)基中，次日加入選擇性培養(yǎng)基。 Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉(zhuǎn)染步驟： 以下步驟適用于在6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。開始時(shí)，每6孔培養(yǎng)板使用0.4 ug DNA。盡管DNA的量看起來(lái)很少，但已足夠用于轉(zhuǎn)染。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)每種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。 1.轉(zhuǎn)染前一天，用5ml含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每6孔培養(yǎng)板含2-8×105的細(xì)胞（根據(jù)細(xì)胞類型而定）。 2.在細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)（通常37℃和5％CO2）。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)40-80％融合。 3.轉(zhuǎn)染時(shí)，用DNA濃縮緩沖液（EC Buffer）稀釋1 ug DNA至100 ul總體積（DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低濃度：0.1ug/ul）。加入3.2 ul Enhancer，渦旋1s以混合溶液。 重要：請(qǐng)保持DNA與Enhancer比例恒定。 注意：質(zhì)粒DNA的質(zhì)量會(huì)顯著影響幾個(gè)轉(zhuǎn)染參數(shù)如轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性、以及對(duì)于結(jié)果的解釋。因此，只應(yīng)該使用最高純度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提純化的質(zhì)粒適合于大多數(shù)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。要獲得最好的重復(fù)性和最好的結(jié)果，我們推薦使用Endofree Plasmid Kit，該試劑盒可以快速有效地在質(zhì)粒純化過程中去除細(xì)菌內(nèi)毒素，從而獲得最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。 4.室溫（15-25℃）孵育2-5分鐘，離心（spin down）幾秒鐘以從管頂去除液滴。 5.向DNA-Enhance混合液中加入10ul Effectene Transfection Reagent，反復(fù)吸取5次或渦旋10秒鐘以混合。 注意：沒必要一直把Effectene Reagent置于冰上。在室溫中放置10-15分鐘不會(huì)改變它的穩(wěn)定性。 6.室溫下（15-25℃）孵育5-10分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。 7.孵育過程中，從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液，用4 ml PBS洗滌一次細(xì)胞。加入1.6 ml新鮮培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）到細(xì)胞中。 8.加入0.6 ml培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）至包含轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染復(fù)合物的EP管中。吸取兩次以混合，立即將轉(zhuǎn)染復(fù)合物drop-wise加入6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合物分布均勻。 9.將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間直至轉(zhuǎn)染基因表達(dá)。孵育時(shí)間和由所采用的實(shí)驗(yàn)和所使用的基因決定。 Optional: 大多數(shù)情況下，不需去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然而，如果觀察到細(xì)胞毒性，則需在轉(zhuǎn)染后6-18小時(shí)移除Effectene-DNA混合物，用PBS洗滌一次細(xì)胞，然后加入5 ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。 10.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，進(jìn)一步試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。 轉(zhuǎn)染β-gal 或 cat 報(bào)告基因的重組子常在轉(zhuǎn)染后孵育24-48小時(shí)以使轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)最大化。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，將細(xì)胞以1:5~1:10傳代至合適的選擇性培養(yǎng)基中。保持細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中直至克隆出現(xiàn)。 注意：我們推薦對(duì)每一細(xì)胞系和使用的抗生素建立一個(gè)致死曲線（劑量-反應(yīng)曲線）。但是一定要記住致死曲線受細(xì)胞密度的影響。 以下步驟有時(shí)是必須的：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于它們正常的培養(yǎng)液（如：不含選擇性抗生素的培養(yǎng)液），然后孵育1-2天，然后再加入選擇性培養(yǎng)液。 Superfect Transfection Reagent(Qiagen) 轉(zhuǎn)染步驟： 以下步驟適用于在6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)每種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。 1.轉(zhuǎn)染前一天，用含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每6孔培養(yǎng)板含2-8×105的細(xì)胞（根據(jù)細(xì)胞類型而定）。 2.在細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)（通常37℃和5％CO2）。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)40-80％融合。 3.轉(zhuǎn)染時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2 ug DNA至100 ul總體積（DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低濃度：0.1 ug/ul）�；旌希x心幾秒鐘以從管頂去除液滴。 注意：質(zhì)粒DNA的質(zhì)量會(huì)顯著影響幾個(gè)轉(zhuǎn)染參數(shù)如轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性、以及對(duì)于結(jié)果的解釋。因此，只應(yīng)該使用最高純度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提純化的質(zhì)粒適合于大多數(shù)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。要獲得最好的重復(fù)性和最好的結(jié)果，我們推薦使用Endofree Plasmid Kit，該試劑盒可以快速有效地在質(zhì)粒純化過程中去除細(xì)菌內(nèi)毒素，從而獲得最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。 4.向DNA稀釋液中加入10 ul Superfect Transfection Reagent，反復(fù)吸取5次或渦旋10秒鐘以混合。 注意：沒必要一直把Superfect Reagent置于冰上。在室溫中放置10-15分鐘不會(huì)改變它的穩(wěn)定性。 5.室溫下（15-25℃）孵育5-10分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。 6.孵育過程中，從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液，用2ml PBS洗滌一次細(xì)胞。 7.加入600 ul培養(yǎng)液（包含血清和抗生素）至包含轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染復(fù)合物的EP管中。吹打兩次以混合，立即將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合物分布均勻。 8.將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育2-3小時(shí)。 9.小心移除Superfect-DNA混合物，用2 mlPBS洗滌3-4次細(xì)胞 10.加入新鮮的正常培養(yǎng)基，孵育24-48小時(shí)。 11.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，進(jìn)一步試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。 轉(zhuǎn)染β-gal 或 cat 報(bào)告基因的重組子常在轉(zhuǎn)染后孵育24-48小時(shí)以使轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)最大化。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，將細(xì)胞以1:10~1:15傳代至合適的選擇性培養(yǎng)基中。保持細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中直至克隆出現(xiàn)。 注意：我們推薦對(duì)每一細(xì)胞系和使用的抗生素建立一個(gè)致死曲線（劑量-反應(yīng)曲線）。但是一定要記住致死曲線受細(xì)胞密度的影響。 以下步驟有時(shí)是必須的：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于它們正常的培養(yǎng)液（如：不含選擇性抗生素的培養(yǎng)液），然后孵育1-2天，然后再加入選擇性培養(yǎng)液。 |
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