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求助！IP陰性IgG有條帶 已有2人參與
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本人剛做IP，實驗步驟如下： 1) 提取腦組織的蛋白原液如上所述，并將蛋白濃度調成5 μg/μl； 2) 向蛋白上清中加入10 μl的兔抗ASC抗體到500 μg總蛋白中，4 ℃緩慢搖勻混合物反應過夜，IgG對照組使用兔源IgG代替兔抗ASC的抗體； 3) 向每支蛋白抗體混合液中加入30 μl protein A瓊脂糖珠與抗原抗體復合物反應，4℃緩慢搖勻抗原抗體混合物室溫反應4 h； 4) 4℃ 8000 rpm離心2 min，去除上清液，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，用低溫的RiPA 裂解液沖洗5遍，300 μl/遍； 5) 向瓊脂糖珠-抗原抗體復合物中加入100 μl的2×Loarding Buffer上樣緩沖液，輕輕震蕩混勻； 6) 95 °C煮沸10 min，4℃ 8000 rpm離心2 min，收集上層液，冷卻后可放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫? 我用的ASC是rabbit來源的，陰性對照就用的normal rabbit IgG, 結果檢測條帶時，孵caspase-1 和ASC，兩個泳道都會出現(xiàn)條帶，而且陰性的條帶更粗，這是怎么回事？ input: ASC(rabbit) normal rabbit IgG 圖片1.jpg |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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IgG有條帶的話，你可以換一種IgG（其他廠家的），不知道你的IgG用的總蛋白是多少，你可以IgG陰性對照只用1/5的蛋白上清，IgG的量也只用1/5，同時多設幾個IgG對照（幾個不同公司的IgG），同時IP，選最后檢測結果最好的那個。 另外，你的圖片和上面標的文字對不上，不知道是哪個有條帶哪個沒有條帶，如果是ASC和IgG都有條帶，可能和你洗的條件有關，RIPA裂解液洗5遍可能還是不夠，你可以試試250mM的LiCl溶液洗5遍，或者先低鹽，再高鹽，再LiCl，再TE buffer，LiCl溶液洗5遍更嚴格。 |
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pyhuijie2樓2016-07-14 12:00:07
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3樓2016-07-14 12:05:39
4樓2016-07-16 19:28:51
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