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RNA酶保護試驗（RPA） 已有1人參與
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一、RNA酶保護試驗（RPA） RNA酶保護試驗（（RNase Protection Assay，RPA）即糖核酸酶保護實驗（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。本文主要介紹了核糖核酸酶保護分析實驗的從試劑準(zhǔn)備到、操作步驟以及實驗結(jié)果全部的操作流程，供大家分享。 二、材料準(zhǔn)備及操作步驟 試劑準(zhǔn)備 1. GACU POOL：取100 mM ATP、CTP、GTP各2.78 μl、100 mM UTP 0.06 μl，加DEPC H2O至100 μl。 2. 雜交緩沖液 IPES 0.134 g、0.5 M EDTA（pH8.0）20 μl、5 M NaCl 0.8 ml、甲酰胺8 ml，加DEPC H2O至10 ml。 3. RNase消化液：5 M NaCl 120 μl、1 M Tris-HCl（pH7.4） 20 μl、0.5 M EDTA（pH 8.0）20 μl、RNase A（10 mg/ml） 8 μl、RNase T1（250 U/μl） 1μl，加DEPC H2O至2 ml。 操作步驟 1.反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。 （1）設(shè)計含T7啟動子的PCR引物 由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列： T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG 引物設(shè)計的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計相同。PCR產(chǎn)物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設(shè)計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性。 （2）PCR：先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產(chǎn)物為模板，用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR。 （3）探針合成標(biāo)記與純化 在0.5ml 離心管中加入下列試劑： RNasin （40 U/μl） 0.5 μl GACU POOL GAC （含GTP、CTP、ATP各2.75 mM，UTP 61 μM） 2 μl [α-32P]UTP（10 μCi/μl） 2.5 μl DTT （二硫蘇糖醇，0.1 M） 1 μl 5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2 μl 模板（50 ng/μl） 1 μl T7 RNA 聚合酶 （15 U） 1 μl 混合后，短暫離心，37℃保溫1 hr。 加入DNaseⅠ（10 U/μl）1 μl， 37℃ 15 min， 然后75 ℃ 10 min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。 加入：飽和酚 50 μl 氯仿 50 μl 酵母tRNA（2 μg/μl） 4 μl DEPC H2O 100 μl 室溫下充分混勻，離心10000 g×2 min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100 μl氯仿，混勻，離心10000 g×2 min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5 ml 離心管中，再加入3 M NaAc 10 μl、預(yù)冷無水乙醇250 μl，混勻后，-20℃靜置30 min。4℃離心13500 g×10 min。棄上清液，沉淀用75%乙 醇100 μl洗滌，4℃離心13500 g×2 min， 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50 μl雜交緩沖液溶解沉淀，4℃下保存待用�？捎媚蛩�-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質(zhì)量。 2.雜交 （1） RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1 μg/μl。 （2）取8μl RNA加入1-3 μl探針（根據(jù)探針檢測結(jié)果調(diào)整）于0.5 ml 離心管中。 （2） 80℃保溫2 min，然后40-45℃下雜交12-18 hr。 3. 消化 （1） 雜交管于37 ℃保溫15 min，加入RNase消化液，37 ℃保溫30 min。 （2） 加入10%SDS 10 μl、10 μg/μl蛋白酶K 20 μl，混勻，37 ℃保溫10 min。 （3） 加入65 μl飽和酚和65 μl氯仿，混勻，室溫離心，10000 g×2 min。 （4） 轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中，加入10 μl 酵母tRNA和3 M NaAc 15 μl，再加入200 μl 異丙醇，混勻后，置-20℃ 30 min，4 ℃離心，135000 g×10 min。 （5） 棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8 μl 上樣緩沖液溶解沉淀。 4、電泳與放射自顯影 （1）配制凝膠：（50 ml） 40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25 ml 5×TBE 10 ml 尿素 24 g 加H2O至50 ml 溶解后加入25%過硫酸胺50 μl，TEMED 50 μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。 （2）預(yù)電泳 以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預(yù)電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應(yīng)達(dá)2000 v以上，功率設(shè)定為100 w，溫度設(shè)為50℃。待膠板溫度達(dá)50℃時，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣。 （3）加樣 將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80℃加熱2 min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2 hr。（電泳條件同預(yù)電泳）。 （4） 電泳結(jié)束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光結(jié)束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。 |
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2樓2017-10-30 15:36:43
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