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xmczhby新蟲 (小有名氣)
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[交流]
RNA蛋白免疫沉淀技術(shù)簡(jiǎn)介
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一、RNA蛋白免疫沉淀技術(shù)簡(jiǎn)介 RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。RIP這種新興的技術(shù)運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對(duì)不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等）。RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。 二、Millipore基于磁珠的RIP實(shí)驗(yàn)流程 1. RIP 實(shí)驗(yàn)基本原理： （1）用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白。 （2）防止非特異性的RNA的結(jié)合。 （3）免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來。 （4）結(jié)合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量測(cè)序（RIP-Seq）方法來鑒定。 2. 延伸閱讀：95%的人類基因組并不編碼基因，而是產(chǎn)生大量的非編碼RNA,真正編碼蛋白質(zhì)的基因只占人類總基因組的約2%。這些非編碼RNA在生命的生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，與艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多種病變密切相關(guān)，并且參與著干細(xì)胞和表觀遺傳學(xué)調(diào)控。而RNA-蛋白復(fù)合物驅(qū)動(dòng)了幾乎所有細(xì)胞過程的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，包括剪接（splicing）、出核轉(zhuǎn)運(yùn)（nuclear export）、mRNA 穩(wěn)定性以及蛋白轉(zhuǎn)譯過程，因此，對(duì)基因調(diào)控的了解就有賴于確定這些過程中RNA的結(jié)合的變化。因此，RNA研究也被越來越多的科學(xué)家重視起來，目前已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中一個(gè)炙手可熱的領(lǐng)域，而RIP技術(shù)也逐漸成為RNA研究領(lǐng)域的一項(xiàng)常規(guī)方法，幫助我們了解越來越受關(guān)注的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 |
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