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RNA的Nouthern印跡和狹線雜交分析實驗 已有1人參與
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Northern blot 是研究基因表達的最嚴謹?shù)姆椒ㄖ唬梢远糠治鼋M織中某一特異 mRNA 的表達豐度，根據(jù)其遷移位置也可以判斷基因表達轉(zhuǎn)錄物的大小。該技術應用十分廣泛，常用于分析 RNA 樣品中特定 mRNA 的 大小和豐度，也可用于基因表達調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)及功能、遺傳變異等研究。 實驗材料 RNA 試劑、試劑盒 DEPC MOPS 甲醛 瓊脂糖 乙酸銨 NaOH NaCl Tris·Cl 磷酸鈉 溴化乙錠 SDS 儀器、耗材 離心機 電泳儀 培養(yǎng)箱 紫外線透照儀 雜交爐 實驗步驟 1. 用72 ml 水溶解1 g 瓊脂糖，在水浴中冷至60℃時，移至通風櫥中加入10×MOPS電泳緩沖液和18 ml 12.3 mol/l 甲醛。 2. 鋪制凝膠使之凝固，拔去梳子，將凝膠放進電泳池，加入足夠的1×MOPS電泳緩沖液使能淹沒凝膠面1 mm 左右。 3. 將每份樣品的體積用水調(diào)整至11 μl，然后加入： （1）5 μl 10×MOPS電泳緩沖液 （2）9 μl 12.3 mol/l 甲醛 （3）25 μl 甲酰胺 （4）在漩渦混合器振蕩混勻，并在微量離心機中短暫離心5~10 s 回收液滴，然后在55℃保溫15 min。 4. 加入10 μl 醛加樣緩沖液，在旋渦混合器中振蕩，并在微量離心機中稍加離心以回收液滴。 5. 每分樣品在一對加樣孔中分別加入0.5~10 μg RNA樣品，以便可取半片凝膠進行染色顯。 6. 在5 V/cm 電壓降下電泳至溴酚藍染料泳動了凝膠長度的一半或三分之二。 7. 用溴化乙錠染色 （1）取出凝膠，切下需要染色的泳道。 （2）放置于無RNa酶的玻璃平血，加 入足夠量的0.5 mol/l 乙酸銨覆蓋，浸泡20 min 換液再泡20 min 以除去甲醛。 （3）傾去液體，加入含0.5 μl /ml 溴化乙錠的0.5 mol/l 乙酸銨，染色40 min。 （4）必要時以0.5 mol/l 乙酸銨脫色1 h。 8. 用吖啶橙染色 （1）取出凝膠，切下需要染色的泳道。 （2）在含10 μg/l 吖啶橙的1.1 mol/l 甲醛/10 mmo/l 磷酸鈉中染色2 min。 （3）在不含吖啶橙的同樣液體中脫色20 min。 9. 在紫外線透照儀中使凝膠中的RNA顯跡，沿凝膠的邊緣放一把尺子拍照，以便隨后能確定膜中的條帶。 10. 將非染色的部分凝膠放置于無RNA酶的玻璃平皿，加足夠的去離子水浸洗幾次以除去甲醛。 11. 凝膠浸泡在10倍體枳的0.05 mol/l NaOH/1.5 mol/l NaCl中30 min，使RNA部分水解。 12. 接著浸泡于10倍體積的0.5 mol/l Tris·Cl（pH7.4）/1.5 mol/l NaCl緩沖液中和30 min。 13. 將溶液換成10倍體枳的20×SDS，浸泡45 min。 14. 在玻璃或塑料平皿中放置一比凝膠略大的矩形海綿（必要時，可并排放兩塊或更多）加入足夠的20×SDS以使海綿半淹沒在液體中。 15. 構(gòu)筑轉(zhuǎn)移平臺，剪3張與海綿同樣大小的Whatman 3 MM 濾紙，放在海綿表面，并以20×SDS潤濕。 16. 把凝膠置于濾紙表面，用玻璃吸管在其表面滾動擠壓去除氣泡，切4條塑料保鮮瞋覆蓋在凝晈的邊緣。 17. 剪一片與凝膠暴露面枳大小相當?shù)哪猃埬せ蛳跛崂w維素膠膜，在一個無RNA酶的玻璃平皿中加入約0.5 mm深的去離子水，將膜漂住水面使之潤濕，直至膜沉沒在水中。 18. 如果是尼龍膜，只需讓膜在水中泡上5 min，如杲是硝酸纖維素膜，換成20×SDS再浸泡10 min。 19. 將潤濕了的膜放在凝膠表面，排去氣泡，以20×SDS洗膜表面。 20. 切5張與膜大小相 當?shù)腤hatman 3 MM 濾紙，放于膜的表面。 21. 然后將切得如膜大小相當?shù)募埥碚R地堆放在濾紙的表面，高約4 cm。 22. 在紙堆的頂部放一塊玻璃平板，壓一重物（0.2~0.4 kg），放置過夜。 23. 拆卸轉(zhuǎn)移裝置，回收膜和壓扁了的凝膠，在膜上用鉛筆標上加樣孔的位置和方向。 24. 用2×SDS洗膜，然后放在一張Whatman 3 MM 濾紙上，讓膜完全干燥 25. 硝酸纖維素膜的處理：將膜夾在兩張Whatman 3 MM 濾紙中，80℃真空烤膜2 h。 26. 尼龍膜的處理：如上述方法烤膜或?qū)⒏傻哪ぐ谀芡高^紫外線的塑料保鮮膜中，將有RNA的一面朝下，用紫外線透照儀照射合適的時間。 27. 如需要的話，凝膠可按步驟7或8操作，用溴化乙錠或吖啶橙染色以檢查轉(zhuǎn)印效率，或在含0.03%（w/v）亞甲藍的0.3 mol/l pH5.2的乙酸鈉緩沖液中染色45 s，在水中脫色2 min。 28. 制備放射比活在108 dpm 以上的寡核苷酸探針，并除去未標的寡核苷酸。 29. 用6×SSC液潤濕攜帶RNA的膜。 30. 將膜帶RNA的面朝上，放入雜交管中，毎10 cm2 面積加入1 ml 甲酰胺預雜交液/ 雜交液，雜交管在雜交爐中旋轉(zhuǎn)保溫3 h 溫度設定在42℃（DNA探針）或60℃（RNA探針）。 31. 如果是雙鏈探針的話，需在水浴或加熱器中加熱至100℃，保溫10 min，移至冰上。 32. 吸所需要體積的探針加入雜交管中，在雜交爐中于42℃（DNA探針）或60℃（RNA探針）旋轉(zhuǎn)過夜。 33. 倒出雜交液，按以下程序依次洗膜： （1）2×SSC/0.1%SDS室溫旋轉(zhuǎn)洗滌2次，每次5min。 （2）0.2×SSC/0.1%SDS室溫旋轉(zhuǎn)洗滌2次，每次5min（低嚴謹度洗滌）。 （3）于42℃預熱0.2×SSC/0.1%SDS，在此溫度下洗滌2次，每次15 min（中嚴謹度洗滌，可選）。 （4）于68℃預熱0.1×SSC/0.1%SDS，在此溫度下洗滌2次，每次15 min（高嚴謹度洗滌，可選）。 34. 在室溫以2×SSC洗膜，吸干多余液體，蓋上可透過紫外線的塑料保鮮膜，并進行放射自顯影。 |
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2樓2017-01-14 17:30:29
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