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基因克隆連接到T載體是不是多此一舉？
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T載體是TA克隆載體的簡稱，就是利用載體的T末端和PCR產(chǎn)物的A末段連接而將目的基因克隆到載體中的方法。我們都知道，做基因克隆目的基因連接到載體，使目的基因能夠在受體細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定遺傳。部分朋友是把目的片段先克隆到T載體后再酶切連接目的載體的，有部分朋友就直接將PCR產(chǎn)物酶切連接到能夠?qū)⒛康幕驇胧荏w細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定遺傳的載體中。那么進(jìn)行TA克隆到底是不是多此一舉呢？相信有不少朋友都有過這種疑問。 不管你選擇什么順序的基因克隆，首先，要說一下必不可少的幾個步驟：PCR、酶切、測序。 1.PCR 同一管PCR產(chǎn)物回收后，酶切連接做克隆，篩選出若干個PCR陽性的克隆(菌液PCR鑒定)送去測序。大多數(shù)的結(jié)果都是正確的，但是有時候出現(xiàn)送測序的幾個克隆中有的就是有突變，反復(fù)測序都是這樣。個人認(rèn)為其原因在于PCR產(chǎn)物的異質(zhì)性。也就是說，同一管PCR產(chǎn)物中有很多產(chǎn)物，有完全正確的(這部分可能占絕大多數(shù))，有突變的全長，還有微量或者叫痕量的不完全產(chǎn)物。如果PCR產(chǎn)物直接測序，那么由于測序本身的原因，測序引物附近是無法準(zhǔn)確讀出來的，那么可能掩蓋了實際存在的突變。如果就這樣連接進(jìn)去載體了，那么肯定是存在一定的錯誤的。 2.酶切 一般進(jìn)行PCR 的模板采用菌液或基因組DNA。菌液還好，如果是基因組DNA，一般提取的基因組DNA量都不是很多，PCR的量也有限，然后進(jìn)行酶切，而且酶切還存在著酶切效率的問題。假如一個3k的的片段，使用高保真酶25個循環(huán)好不容易或得了產(chǎn)物（不多）但如使用該產(chǎn)物進(jìn)行2次PCR，可以說幾乎所有的片段都存在突變。當(dāng)然也可以先PCR 10個循環(huán)，再進(jìn)行2次PCR，或許突變會少一點。但2次PCR的PCR條件還是要去摸索的。萬一模板用完了，得不償失。如果在第一獲得了PCR產(chǎn)物的時候進(jìn)行T連，T連成功后測序，如正確，再從質(zhì)粒中進(jìn)行PCR，突變的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于從低拷貝的模板（如cDNA）中進(jìn)行PCR。無論從時間上還是金錢上使用T載體是合算的。 3. 測序 PCR產(chǎn)物酶切后連接進(jìn)去做好克隆測序一次。如果是連接T載體測序，測序正確后酶切連接在進(jìn)行一次測序，至少要車兩次。測序一次大概至少需要4天時間，來來回回如果兩次測序的話會耽擱很多時間，那就太耗費時間了。 如果是SNP，我認(rèn)為完全可以用PCR測序，雖然可能出現(xiàn)我上面說的一些突變，但是SNP要以量取勝。也就是樣本量N多的時候?qū)ψ詈蟮慕Y(jié)果分析就沒有多大影響了。 工欲善其事，必先利其器!磨刀不誤砍柴工! 畢竟你不能保證無論多么難的片段，PCR－酶切－連接－測序都能一次成功。一般的克隆，PCR直接連就可以了。但也有的情況使用T載體可能更好，PCR產(chǎn)量低，模板珍貴，二次PCR突變較多等情況，可以使用T載體。畢竟T載體的連接效率相對較高。雖然后一種比較麻煩了一點，但是比較穩(wěn)當(dāng)一點。兩種方法各有優(yōu)缺點，大家根據(jù)自己的實驗慎重選擇�。�！ 分享： 0 喜歡 |
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