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gene121木蟲 (著名寫手)
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[交流]
【實驗】RNA抽提指南(TRIZOL法)
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RNA抽提指南(TRIZOL法) 注意事項： * 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌，可能污染RNA的抽提 并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習慣預(yù)防微生物污染。 * 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀 器所導致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶 A 或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可 能富含RNA酶。 * 在TRIZOL 中，RNA 是隔離在RNA 酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操 作會要求用無RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150°C 的烘箱中烘烤4 小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘， 用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。 抽提步驟： 1．勻漿化作用 通過離心來沉淀細胞后，棄上清，用移液管加TRIZOL試劑反復(fù)吹打來裂解細胞至均一通亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在15—30°C 條件下孵育5 分鐘以使核蛋白體完全分解。 （每5—10×106的動物細胞，植物或酵母菌細胞或每1×107 細菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應(yīng)避免洗滌細胞因為那樣會增加mRNA降解的可能性。） 2．分離階段 每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15 秒并將其在30°C 下孵育2—3 分鐘。在2—8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心15 分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA 無一例外地存在于水樣層當中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL 容量的60% 3．RNA的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時的每1 mlTRIZOL 對應(yīng)0.5 ml 異丙醇。將混合的樣品在 15—30°C 條件下孵育10 分鐘并在2—8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心10 分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。 （如果希望分離DNA 和蛋白，有機層同樣要予以保留。在除去水樣層后，樣品中的DNA 和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA 對于樣品間標準化RNA 的產(chǎn)量十分有用。） 4．RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA 沉淀一次，每1 ml 的TRIZOL 至 少加1 ml 的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8°C 下以不超過7,500×g 的離心力高速冷凍離心5 分鐘。 5．RNA的再溶解 在操作的最后，簡單干燥RNA沉淀。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那 樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA，并在55—60°C下孵育10 分鐘。 TRIzol法抽提總RNA 組織100mg ↓ 加1mlTRIzol ↓ 勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管） （組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管） ↓ 顛倒混勻10下，室溫5分鐘（30°C孵育） ↓ 加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5） ↓ 顛倒混勻15S，室溫2-5分鐘（30°C孵育） ↓ 4℃，離心12000g，15分鐘 ↓ 轉(zhuǎn)上層水相（約400μl）于另一1.5mlEP管中 ↓ 加等體積異丙醇（約400 -500μl），混勻室溫10分鐘 ↓ 4℃，離心12000g，10分鐘（30°C孵育） ↓ 棄上清 ↓ 加冰預(yù)冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml ↓ 4℃離心7500g，5分鐘 ↓ 棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl） （可在55-60℃水中，<10分鐘助溶） [ Last edited by gene121 on 2005-7-13 at 21:56 ] |
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