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feixieliuli銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于原核表達(dá)包涵體純化復(fù)性的問(wèn)題 已有2人參與
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大腸桿菌表達(dá)的帶His標(biāo)簽的蛋白，上清和包涵體均有。 上清放置2天左右，目的蛋白沉淀很嚴(yán)重，若破菌之后馬上純化，在500mM咪唑洗脫時(shí)目的蛋白沉淀很嚴(yán)重，加入0.2%SLS，沉淀消失。 包涵體是用4M尿素過(guò)夜溶解的，溶解的很充分，上鎳柱純化時(shí)，在100mM咪唑洗脫時(shí)嚴(yán)重沉淀（沉淀為目的蛋白），加0.2%SLS沉淀不溶解。500mM咪唑洗脫（洗脫下來(lái)目的蛋白濃度很高）時(shí)沉淀嚴(yán)重，加入0.2%SLS之后，加速沉淀，用不含咪唑的A液（4M尿素，20mM Tris，0.15M NaCl）稀釋洗脫液，也會(huì)加速目的蛋白沉淀，但是用B液（4M尿素，20mM Tris，0.15M NaCl，500mM 咪唑）稀釋沉淀消失。沉淀消失之后加0.2%SLS則不會(huì)引起沉淀。 復(fù)性時(shí)，直接把500mM咪唑純化樣品（含4M尿素）透析到復(fù)性液（0M尿素），透析袋剛放入復(fù)性液，透析袋中馬上出現(xiàn)沉淀，將蛋白離心之后繼續(xù)復(fù)性，然后就不會(huì)沉淀，復(fù)性好之后的樣品得率很低，但是Elisa結(jié)果很好。 復(fù)性前樣品含有0.2%SLS效果較差。 求大神分析一下這種原因及解決辦法。 PS:8M尿素溶解樣品復(fù)性之后效果很差。 |
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