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病毒包裝的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié) 已有3人參與
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在做病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，有科研工作者常遇到：用同樣一個(gè)病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝實(shí)驗(yàn)，為什么有人做的很好，次次成功，有人卻是時(shí)常做不出來，穩(wěn)定性很差，不是滴度低就是根本不出毒，從我們對(duì)不同載體系統(tǒng)病毒包裝的多 年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，主要以下幾個(gè)方面心得： 第一，病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)就是細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)(盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng))、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制(24、48 小時(shí)的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷)、目的基因?qū)Σ《景b影響(基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會(huì)影響到是否能包裝成功)。 第二，如果有細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的常規(guī)經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞因素應(yīng)該沒有什么問題(細(xì)胞培養(yǎng)人員一定要關(guān)注，包裝或轉(zhuǎn)染感染前一定要重視細(xì)胞干凈細(xì)微污染與否、飽滿立體感是否好、鋪板均勻細(xì)胞密度適中否)，細(xì)胞產(chǎn)毒出毒期間過程中的活力是包裝正常和出來的病毒滴度高低的一個(gè)重要環(huán)節(jié)(正常包裝出病毒情況，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝一個(gè)細(xì)胞出一個(gè)病毒顆粒，腺病毒是1000 個(gè)，腺相關(guān)病毒是10000 個(gè))，所以實(shí)踐操作表明，病毒包裝轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的密度要控制，使得收毒(72 小時(shí))時(shí)細(xì)胞密度在90%-95%左右。 第三，建議使用商品化的成熟毒載體系統(tǒng)(不要用來路不清或基本被淘汰很少人在使用的系統(tǒng))，從文獻(xiàn)和我們多年的實(shí)踐可以結(jié)論，這類系統(tǒng)是穩(wěn)定的，因而分析原因時(shí)盡量少花精力在對(duì)載體系統(tǒng)的驗(yàn)證上，這樣會(huì)白花力氣。 第四，至于包裝轉(zhuǎn)染時(shí)的操作控制細(xì)節(jié)及其轉(zhuǎn)染試劑因素，只要在操作時(shí)按相關(guān)使用說明和操作步驟，應(yīng)該沒有大問題，所以也不要白花太多精力在這上面。 第五，另一個(gè)需要重點(diǎn)關(guān)注和排查的因素就是目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建和抽提純化環(huán)節(jié)，是否構(gòu)建時(shí)導(dǎo)致質(zhì)粒載體重組或某個(gè)部件缺失，或污染別的質(zhì)�；螂s物?中抽純化是否污染?是否抽提的是別的質(zhì)粒?要養(yǎng)成同時(shí)做陰性對(duì)照的習(xí)慣(是否目的基因載體和陰性對(duì)照GFP 載體是同一批，建議同一批，建議每次包裝都如此操作)，如果這個(gè)環(huán)節(jié)沒有啥問題，在構(gòu)建中出現(xiàn)重組和缺失、或抽提純化失敗的可能性也不大。 第六，落實(shí)了上面那些因素，那就是最后一個(gè)原因。目的基因的大小、序列情況、該目的蛋白的功能毒性等導(dǎo)致無(wú)法包裝成功(實(shí)踐中，這種情況是有的，我們偶爾會(huì)遇到，可能原因是一些基因表達(dá)翻譯后對(duì)包裝細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)異常)，那么我們能做的就是換病毒包裝載體系統(tǒng)，嘗試其他載體系統(tǒng)能否包裝出來。不過這種情況出現(xiàn)的幾率非常低，你做上100 個(gè)基因，也可能碰不上一個(gè)。 因而總的來說，我們進(jìn)行病毒包裝實(shí)驗(yàn)時(shí)要重視包裝材料——細(xì)胞及表達(dá)質(zhì)粒(對(duì)拿過來的細(xì)胞和載體系統(tǒng)要驗(yàn)證，常出現(xiàn)包裝細(xì)胞、空表達(dá)載體質(zhì)粒就有問題，我們要定期純化生產(chǎn)包裝細(xì)胞、空表達(dá)載體質(zhì)粒)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)讓它“白白胖胖、活力充沛”，目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建純化良好，質(zhì)粒間比例得當(dāng)，病毒包裝實(shí)驗(yàn)還是能有較好的結(jié)果。 版主cheff0412留言: 不要在文中附上公司鏈接 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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你好，請(qǐng)問我用293T包裝病毒之后，24小時(shí)換液發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解了，這是正常情況嗎？病毒包完對(duì)細(xì)胞狀態(tài)有影響嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-03-10 17:15:47
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2016-08-19 13:55:21, 158.19 K
3樓2016-08-19 13:58:04
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