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銅蟲 (小有名氣)

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[交流] 細(xì)胞自噬發(fā)生與檢測(cè) 已有1人參與

過去十年，幾乎每個(gè)生命科學(xué)者都知道“凋亡”這個(gè)概念且有意無意地將自己的研究工作與之掛鉤，催生了大量文章。同樣我們有理由堅(jiān)信未來十年“自噬”也會(huì)變成另一個(gè)“萬金油”和生命科學(xué)的“閃亮新星”。下面將為大家介紹“自噬”的精彩內(nèi)容。

細(xì)胞自噬

自噬（Autophagy）是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種高度保守的代謝過程，是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食（Self-eating）”現(xiàn)象。它作為細(xì)胞內(nèi)的主要降解途徑，將胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)降解。它主要有三種形式：大自噬，小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。

自噬發(fā)生與調(diào)節(jié)：

自噬的誘導(dǎo)主要由 ULK1、FIP200、Atg13 三種蛋白形成的ULK1復(fù)合物與雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)之間相互作用實(shí)現(xiàn)的，成核過程與ClassIII PI3K(Vps34)-Beclin-1 復(fù)合物密切相關(guān)。自噬體在延伸階段主要依賴于兩個(gè)泛素化復(fù)合系統(tǒng)，即 Atg12 的結(jié)合過程與 LC3  的修飾過程，且都需要泛素活化酶 E1 和 E2 的參與。自噬體的成熟主要是指自噬體通過微管骨架，在轉(zhuǎn)運(yùn)必須內(nèi)吞體分類復(fù)合物(ESCRT)和單體 GTP 酶(RabS)作用下與溶酶體融合形成自噬溶酶體的過程，有些溶酶體相關(guān)蛋白也參與了其中，包括 LAMP1、LAMP2、UVRAG (紫外線抵抗相關(guān)腫瘤抑制基因）。而在降解階段自噬體蛋白也發(fā)揮了重要作用，如 Atg22、Atg12、Atg15、Atg1、Atg13 等。細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)是一個(gè)多步驟的極其復(fù)雜的過程，目前機(jī)制尚未完全掌握，已知它主要是通過mTOR 信號(hào)通路、Beclin-1 信號(hào)通路、P53 信號(hào)通路三條途徑來進(jìn)行調(diào)控的。

1） mTOR 信號(hào)通路：mTOR 是是一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶，能接受多種上游信號(hào)，如 Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受營養(yǎng)和能量的變化。mTOR 存在兩種不同形式：對(duì)雷帕霉素敏感的 mTOR 復(fù)合物1（mTOR1）和對(duì)雷帕霉素不敏感的 mTOR 復(fù)合物2（mTOR2）。

2） Beclin-1 信號(hào)通路：Beclin-1 是酵母自噬基因 Atg6/Vps30 的同源基因，能與多種蛋白結(jié)合，如 Vps34（Class III PI3K  的催化亞單位），mTOR，BCL-2 和 BCLXL 蛋白等，beclin-1 是一個(gè)多功能蛋白，除了接受自噬信號(hào)，它還可以接受很多其它的信號(hào)對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3） P53 信號(hào)通路：在細(xì)胞核中，P53 能與多種蛋白作用，如 sestrin1/2 蛋白、DAPK1、BCL-2  家族、DRAM1 等作用，發(fā)揮上調(diào)細(xì)胞的自噬水平功能。而在細(xì)胞質(zhì)中，P53 能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬水平的功能。

自噬檢測(cè)：

LC3 是自噬標(biāo)志物，自噬形成時(shí)，胞漿型 LC3（即 LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即 LC3-II），LC3-II/I 比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。LC3 這一轉(zhuǎn)變過程可被 Western Blot 和熒光顯微鏡檢測(cè)到，現(xiàn)已成為監(jiān)測(cè)自噬體形成的推薦方法。在哺乳動(dòng)物中，LC3 包含 3 種亞型：LC3A、LC3B、LC3C，分布在不同的組織中，因此需要用不同的抗體去鑒定這3種亞型。

GFP-LC3 單熒光自噬指示體系：

利用 LC3 在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象構(gòu)建了 GFP-LC3 指示體系，無自噬時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系：

mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒產(chǎn)品 mRFP 用于標(biāo)記及追蹤 LC3，GFP 的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體。由于 GFP 熒光蛋白對(duì)酸性敏感(pH 敏感)，當(dāng)自噬體與溶酶體融合后 GFP 熒光發(fā)生淬滅,而 mRFP 相對(duì)穩(wěn)定，因此只能檢測(cè)到紅色熒光。

1. 哺乳動(dòng)物 LC3 表達(dá)質(zhì)粒

plenti-CMV-EGFP-LC3 質(zhì)粒

plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 質(zhì)粒

2. LC3 細(xì)胞自噬病毒

plenti-CMV-EGFP-LC3慢病毒

plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 慢病毒

plenti-CMV-EGFP-LC3 腺病毒

plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 腺病毒

文獻(xiàn)支持（部分）

1. Autophagy  10:10, 1-13; October  2014

Endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin and thapsigargin protects against transient ischemic brain injury Involvement of PARK2-dependent mitophagy

2. Autophagy 10:6, 972-985; June  2014

Small molecule-driven mitophagy-mediated NLRP3 inflammasome inhibition is responsible for the prevention of colitis-associated cancer

3. Autophagy: 25 April  2015

Small molecule-driven mitophagy-mediated NLRP3 inflammasome inhibition is responsible for the prevention of colitis-associated cancer

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1樓 2016-08-17 11:12:34

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小九537

鐵蟲 (初入文壇)

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越來越多的生命過程被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞自噬相關(guān)

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2樓2016-09-15 09:27:41

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