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小揚(yáng)仔新蟲 (小有名氣)
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[求助]
植物原生質(zhì)體制備和吸水膨脹、磷酸化蛋白WB和磷酸化蛋白體外降解問題
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1.最近想做水孔蛋白磷酸化影響植物吸水實(shí)驗(yàn)，但是原生質(zhì)體按照文獻(xiàn)中cut into small pieces that were finally transferred to 3 ml enzymatic digestion medium (ES-500M: 500mM mannitol, 10 mM MES/KOH (pH 5.8), 10 mM CaCl2, 10 mM KCl) plus 1% (w/v) cellulase Onozuka R10 (Duchefa, Haarlem, The Netherlands) and 1% (w/v) macerozyme R10 (Duchefa, The Netherlands The protoplasts were prepared in the dark with gentle shaking for two to three hours, filtered through a 50-m nylon filter, centrifuged at 80 g at 4 °C for 5 min, and washed three times with ice-cold ES-500M without enzymes. Protoplasts were stored in the dark on ice for at least 30 min before an experiment was started. 酶解3小時(shí)并沒有原生質(zhì)體出來。不知道是什么原因？ 由于磷酸化蛋白容易降解，不知道酶解時(shí)間長了會(huì)不會(huì)影響磷酸化蛋白的降解，從而影響結(jié)果。想問一下離體植株磷酸化蛋白體外多長時(shí)間降解呢？ 2.做磷酸化蛋白的WB 提取蛋白后可以在-20 保存多長時(shí)間？還是必須提取完之后立刻做呢？  求大神們解答 ，萬分感激�。。� |
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葡萄酒澤亞
新蟲 (初入文壇)
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2樓2017-11-24 17:01:15
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