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xmczhby新蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
mRNA 在網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中的翻譯
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從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取的 mRNA 或通過(guò)克隆化 DNA 在體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 在無(wú)細(xì)胞提取液中能被翻譯而合成蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)可用于免疫沉淀試驗(yàn)或進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)材料 家兔 胰核糖核酸酶 小球菌核酸酶 I 型磷酸肌酸激酶 試劑、試劑盒 乙酰苯肼 溶液A 溶液B 滅菌重蒸水 CaCl2 EGTA 氯高鐵血紅素儲(chǔ)存液 亞精胺 磷酸肌酸 氨基酸 DTT HEPES 水 KCl 乙酸鎂 [35S] 甲硫氨酸 儀器、耗材 電泳裝置 干酪包布 離心機(jī) 實(shí)驗(yàn)步驟 一、材料與設(shè)備 (一）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的制備 1)2〜3 kg 的家兔 6 只。 2)1.2% 乙酰苯肼，用 1moL/LHEPES(pH7.0) 中和至 PH7.5。 3) 溶液 A:140 mmol/LNaCL,l.5 mmol/L 乙酸鎂，5 mmol/LKCL,0.001% 肝素 4) 溶液 B:140 mmol/LNaCl,1.5 mmol/L 乙酸鎂，5 mmol/LKC1 5) 滅菌重蒸水 6)lOOmmol/LCaCl2 7)200 mmol/LEGTA(pH7.0) 8) 小球菌核酸酶（150000 單位/ml), 保存于坫氨酸濃度為 50 mmol/L(pH9.2)，CaCl2 濃度為 5 mmol/L 的溶液屮 9)I 型磷酸肌酸激酶 40n^/ml，保存 50% 甘油中） 10) 氯高鐵血紅素儲(chǔ)存液溶于乙二醇，濃度為 5 mg/ml), 氯卨鐵血紅素可按下法制備：在 400ul0.2mol/LKOH 中溶解氯高鐵血紅素（分子質(zhì)暈為 652Da)，分多次緩慢添加，每次添加少量且各次之間應(yīng)振蕩；加入水 600ul, 加入 lmol/LTris-Cl(pH7.8),100ul, 滴加 0.1mol/LHC1 調(diào)節(jié) pH 至 7.8; 加入 4.8 ml 乙二醇，振蕩混合；4°C 以 5000 g 離心除去不溶性沉淀；用 lOmmol/LKCl 按 1:100 的比例稀釋氯高鐵血紅素，讀取 540nm 波長(zhǎng)下的吸光度，推算其濃度（1 mmol/L 氯高鐵血紅素溶液吸光值為 11:1); 用比例為 4:1 的乙二醇：水溶液將氯高鐵血紅素的濃度調(diào)節(jié)至 5 mg/ml 11) 干酪包布。 12) 離心機(jī)。 (二）網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的翻譯 1) 翻譯反應(yīng)混合液：按 K 法配制翻譯反應(yīng)混合液，分裝為 50〜100ul/小份，儲(chǔ)存于一 70℃ 或液氮中。 100 mmmol/L 亞精胺 200ul 800 mmol/L 磷酸肌酸 400ul 5 mmoi/L 氨基酸 (不合甲硫氨酸） 200ul lmol/LDTT 80ul 500 mmol/LHEPES(pH7.4) 1600ul 水 720ul 5 mm0l/L 氨基酸是含冇除甲硫氨酸外的所有氨基酸的溶液，濃度為 5 mmol/L。以 [35S] 甲硫氨酸對(duì)體外合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行放射性標(biāo)記時(shí)可使用這一溶液；如果以其他放射性標(biāo)記氨基酸來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)，則要使用相應(yīng)的作標(biāo)記氨基酸混合液。 2)lmol/LKCl 3)16.5 mmol/L 乙酸鎂 4)T5S] 甲硫氨酸.8O uCi 100〜1200Ci/mmol/L，翻譯級(jí) 5) 胰核糖核酸酶，l00 ug/ml 溶于 50 mmol/LEDTA(pH8.O) 6) 電泳裝置。 二、操作方法 (一）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的制備 1）挑選體重 2〜3 kg 的家兔 6 只，按以卜的程序皮下洼射乙酰苯肼溶液，以獲得貧血家兔的血液。 第一天注射 2.0 ml 第二天注射 1.6 ml 第三大注射 1.2 ml 第四天注射 1.6 ml 第五天注射 2.0 ml 2) 在第七和第八天按以下方法采血：先用酒精棉球擦拭家兔耳朵，然后用一新刀片在耳長(zhǎng)屮段的耳中靜脈做一切口，每只家兔可采集 50 ml 血液，收集于 50 ml 冷卻的溶液A 中。在第七和第八大取血量府適量，第九天可用戊巴比妥或芬太尼（fcntanyl) 麻醉動(dòng)物 后作心臟穿刺放血（約吋采集 150 ml 血液，收集于 100 ml 溶液 A 中） 3) 干酪包布過(guò)濾血液，然后于 4℃ 以 2000 尺離心 5 min, 吸出由密度不均一的內(nèi)細(xì)胞形成的寬沉積帶的淡黃色的 H 細(xì)胞表層，用溶液 B 洗滌沉積的網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞 3 次，最后一次用 5000 g 進(jìn)行離心。 4) 測(cè)量沉積細(xì)胞的體積，與等體積的預(yù)冷火菌雙蒸水混合，于 0℃ 進(jìn)行裂解，Imin 后再于 4℃ 以 20000 g 將裂解液離心 20 min。 5) 在 100 份的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中加入 1 份氯高鐵血紅素和 2 份 CaCl2 溶液，混勻。 6) 加入 0.05 份小球繭核酸酶（150000 單位/ml)，混合后于 20℃ 溫育 15 min, 然后置于冰水浴中冷卻。 7) 加入 1 份 200 mmol/L 的 EGTA(pH7.0)，混句 8) 加入 0.4 汾磷酸肌酸激酶 (4 Gmg/ml), 混勻，把經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞裂解液分裝為 250〜500ul/小份, 保存于一 70℃ 或液氮中， (二）網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的翻譯 1)RNA 或 mRNA 按前面章節(jié)所述方法可獲得 2) 標(biāo)準(zhǔn)翻譯反應(yīng)系統(tǒng)組成如下： 翻澤反應(yīng)混合液 2ul 1mol/LKCl 2ul 16.5 mmol/L 乙酸鎂 1ul [32S] 甲硫氨酸 8ul 小球菌核酸酶處理的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液 10ul RNA 2ul 于 30℃ 溫育 1 h。 3) 體外翻譯反應(yīng)產(chǎn)物 PT 通過(guò)免疫沉淀和 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。 4) 進(jìn)行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，在現(xiàn)有的樣品中加入 0.2 體積的胰核糖核酸酶，于-37℃ 溫育 15 mm 以水解 [35S] 甲硫氨酸-tRNA。之后立即加入 2XSDS 凝膠加樣緩沖液. 并煮沸樣品，加樣電泳。 5) 翻譯反應(yīng)產(chǎn)物中未使用的部分保存于-20℃ 注意事項(xiàng) 1) 網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的翻譯活件取決于所加入的外源 mRNA。小球菌核酸酶在鈣離子存在時(shí)有活性，加入 EGTA 后其消化活性喪失。因此，要確保網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中內(nèi)源 mRNA 消化完全，以免翻譯時(shí)產(chǎn)生雜帶從而影響結(jié)果。 2) 氯高鐵血紅素是起始因子 cIF-2 抑制物的強(qiáng)阯遏劑，若缺少氯高鐵血紅素，網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液經(jīng)短時(shí)間溫育后蛋白質(zhì)合成就會(huì)停止。因此應(yīng)在 20〜80umol/L 范圍內(nèi)對(duì) K進(jìn)行滴定，以取得最佳翻譯條件。 3) 溫和融化網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液，未用完的裂解液盡快放回一 70℃ 或液氮中。 4) 翻譯反應(yīng)中乙酸鎂的濃度依網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液和 mRNA 的不同而小應(yīng)在 0〜1 mmol/L 的濃度范圍內(nèi)對(duì)乙酸鎂進(jìn)行滴定，然耵選用最佳濃度的乙酸鎂來(lái)確定不同濃度的氯化鉀（20〜8OmmoI/L) 對(duì)特定目的 mRNA 的影 響。一般來(lái)說(shuō)，大約 70mol/L 的 KC1 最適于帶帽 mRNA 的翻譯；而對(duì)于非帶帽 mRNA, 其最適濃度是 40 mmol/L 左右。 5) 在反應(yīng)系統(tǒng)中可加入多達(dá) 10ug 的總細(xì)胞質(zhì) RNA 或者 0.2ug 的 poly(A)+mRNA 或體外合成 RNA 至達(dá)到飽和。時(shí)使用poly(A)+mRNA 所得結(jié)果的背景要比使用細(xì)胞質(zhì) RNA 更小些 6) 在翻譯系統(tǒng)中加入飽和量的 mRNA 可剌激 [35S] 甲硫氨酸在可用酸沉淀的物質(zhì)屮的摻入量的增加，可增加到 10〜25 倍。在最佳條件下，25u1 反應(yīng)混合物中約吋摻入 3X106〜5X106 計(jì)數(shù)/min(l〜3uCi) 的 [35S] 甲硫氧酸 7) 使用 10% 三氯乙酸（TCA) 沉淀放射忤標(biāo)記蛋白前，應(yīng)用 0.3moI/LNaOH 于 37°C 溫育 15 min 或 5%〜10%TCA 在 100℃ 加熱 15 min，以此處理反應(yīng)液以破壞 [35S] 甲硫氨酸-tRNA。用 TCA 沉淀少量蛋白質(zhì)后，可測(cè)出蛋白質(zhì)屮 [35S] 甲硫氨酸的摻入量 8) 用 SDS 聚閃烯酰胺凝膠電泳分析網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液時(shí)可能出現(xiàn)背景條帶。時(shí)常出現(xiàn)的那些按表觀分子質(zhì)量為 45kDa 進(jìn)行遷移的多肽得到 放射性標(biāo)記，這一現(xiàn)象以及珠蛋白被標(biāo)記的現(xiàn)象通常都是由硫氨酸中的雜質(zhì)所引起的。對(duì)此問(wèn)題，使用新購(gòu)的放射性標(biāo)甲硫氨酸一般可以避免 9) 雙鏈 DNA 模板在體外轉(zhuǎn)錄時(shí)常產(chǎn)生一定量的雙鏈 RNA, 它將抑制在網(wǎng)織紅細(xì)胞中進(jìn)行的翻澤。如果翻洋效率不高，則應(yīng)盡量減少體外轉(zhuǎn)錄中雙鏈 RNA 的量，同時(shí)將已知在網(wǎng)織紅細(xì)胞中有活性的對(duì)照 RNA4 不同屢的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中產(chǎn)牛的 RNA 相混合， 進(jìn)行翻譯試驗(yàn)。 |
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