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都說RNAi很容易降解，轉(zhuǎn)染效率很低，是真的嗎？
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RNAi就是利用降解雙鏈RNA的酶系統(tǒng)，人工引入一段和目標RNA互補的序列，這樣，在細胞內(nèi)形成雙鏈RNA，誘發(fā)降解機制，使目標RNA降解，無法被進一步翻譯。 在轉(zhuǎn)染過程中，有人就在擔心，dsRNA的穩(wěn)定性是相對于單鏈RNA而言的！RNA怎么辦？ RNAi中，標準的非修飾的siRNA確實容易降解，這不僅在保存過程中，而且在轉(zhuǎn)染過程中。對siRNA的降解，可以合成修飾的雙鏈siRNA，以提高合成中的穩(wěn)定性，使用合成好的siRNA。 不管是什么樣的RNA實驗，最基本的一點就是要嚴防RNase！盡量嚴格做到不要受RNA酶的污染�？梢杂酶邷刈冃�、DEPC等處理使RNase失活就好了！ 所以還是勤快點的好！ 對轉(zhuǎn)染來說，因為要接觸血清，培養(yǎng)基以及細胞內(nèi)酶的作用。這時，好的轉(zhuǎn)染試劑作用就顯現(xiàn)出來了。要做到在血清中游離時，保護siRNA不受培養(yǎng)基中酶和蛋白 的降解、吸附等影響，同時在進入細胞后不被溶酶體降解，并能釋放到細胞質(zhì)中。好的轉(zhuǎn)染策略還不僅有保護的作用，更重要的是濃縮siRNA，不將細胞外的其 他成分，特別是毒性成分，如抗生素、過多的蛋白帶入細胞，以避免細胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)，毒性對RNAi實驗來說，影響非常大。 做RNAi干擾用siRNA還是shRNA進行轉(zhuǎn)染需要根據(jù)您的試驗綜合考慮。 1.選擇siRNA的優(yōu)缺點 選擇siRNA只能瞬時轉(zhuǎn)染，作用周期短，但是siRNA相對與shRNA操作簡便，試驗周期短，轉(zhuǎn)染效率一般優(yōu)于shRNA，主要是優(yōu)于siRNA分子特 性決定的，siRNA轉(zhuǎn)染優(yōu)化一般使用熒光標記的siRNA,在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光的強弱以及分布。熒光特異性比較弱。 2.選擇shRNA的優(yōu)缺點 選擇shRNA可以瞬轉(zhuǎn)也可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，作用周期較長，需要構(gòu)建載體，操作稍微復雜與siRNA,試驗周期較長，轉(zhuǎn)染效率與您的轉(zhuǎn)染手段以及細胞類型有關(guān)。一般用GFP或者Luc檢測轉(zhuǎn)染效率。 不管是原代細胞還是別的類型細胞這兩種方法都是可以選擇，根據(jù)您的試驗需要進行選擇。不論siRNA還是shRNA做原代轉(zhuǎn)染，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，特別轉(zhuǎn)染試劑選擇以及轉(zhuǎn)染手段上需要經(jīng)驗。如果轉(zhuǎn)染效率還是比較低的話可以選擇用流式細胞儀進行分選。 文章來源：英格恩技術(shù)的官方博客，原文詳見：http://www.engreen.cn/2015/08/rnai-tansfection-123 都說RNAi很容易降解，轉(zhuǎn)染效率很低，是真的嗎？ |
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