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無(wú)花草新蟲 (初入文壇)
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[求助]
NcoI單酶切，連接不上 已有5人參與
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大家好，小弟最近在構(gòu)建載體，想以pGEM-T通過(guò)NcoI單酶切構(gòu)建一個(gè)中間載體。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：目標(biāo)片段1和片段2長(zhǎng)度均為2.7kb，通過(guò)TA克隆到pGEM-T載體上，重組T載體分別命名為pGEM-T-P1和pGEM-T-P2。然后想通過(guò)pGEM-T-P1和pGEM-T-P2用NcoI單酶切構(gòu)建pGEM-T-(P1+P2)，但是一直連接不上。 說(shuō)明：pGEM-T載體自帶一個(gè)NcoI酶切位點(diǎn)，片段1和片段2也各帶一個(gè)NcoI酶切位點(diǎn)。pGEM-T-P1用NcoI單酶切得5.2kb+0.47kb(圖 Lane 1)，pGEM-T-P2用NcoI單酶切得2.9kb+2.6kb(圖 Lane 3)，用Lane 1的5.2kb與Lane 3的2.6kb構(gòu)成pGEM-T-(P1+P2)。Lane 2和Lane 4未切質(zhì)粒電泳對(duì)照。 連接片段和載體pmol比試過(guò)3:1, 5:1, 10:1和20:1(且載體的pmol數(shù)在0.02以上，10微升體系)，4度連接過(guò)夜或更長(zhǎng)，載體有去磷酸化，同時(shí)以載體連接轉(zhuǎn)化對(duì)照，長(zhǎng)了2各斑（有背景值）。 從酶切電泳圖可以看出，酶切是成功的。連接酶用的TAKARA的T4連接酶，同時(shí)（同批）做的TA克隆片段連接，后期轉(zhuǎn)化是正常的，說(shuō)明連接酶是沒(méi)有問(wèn)題的，同時(shí)大腸桿菌（DH5α）也是沒(méi)有問(wèn)題的（也用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化做了對(duì)照）。那么可以肯定就是片段的問(wèn)題了，不知道為什么就是連接不上（轉(zhuǎn)化平板不長(zhǎng)斑，或是只長(zhǎng)了一兩個(gè)，可能是背景值了-載體自連）？？？ 問(wèn)題： 1.因?yàn)門載體已經(jīng)連了一個(gè)2.7kb的片段，用NcoI單酶切再要連一個(gè)2.6kb的片段，是因?yàn)門載體的容納能力有限嗎？因?yàn)殚L(zhǎng)片段連接難度大嗎？ 2.需要效果更好的連接酶？ 3.需要換其他株系的大腸桿菌？ 4.單酶切的緣故以及NcoI這種末端導(dǎo)致不好連接？ 請(qǐng)大家?guī)兔獯鹣滦〉艿囊苫�，分析下失敗可能存在的原因，并給出您寶貴的建議，謝謝，感激不盡！ 2016-08-19 11 時(shí) 11 分[2016.8.18(1)]-2.jpg@youlinglyw@biostar2009 |
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2樓2016-09-05 13:17:11
無(wú)花草
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3樓2016-09-05 15:19:29
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4樓2016-09-07 16:49:33
njaloha
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5樓2016-09-14 16:08:45
njaloha
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6樓2016-09-14 16:13:25
霍進(jìn)喜
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我使用過(guò)NEB的單酶切和連接同時(shí)進(jìn)行的，你可以試試，非常有效。 成分 1. PCR片段 2 2. 載體 2 3. 10xNEB T4 Buffer 1.5 4. 10xBSA 1.5 5. Nco I (NEB) 1 6. T4 Ligase (NEB)/高濃度 1 7. ddH2O 6 8. Total 15 反應(yīng)條件 5 hours at 37°C 5 min at 50°C 10 min at 80°C 然后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)即可，可以嘗試一下，希望能幫到你！ |
7樓2016-09-14 16:27:14
xfliu
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8樓2016-09-15 20:13:05
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| The two inserts can be incoperated in construction by one step or by two steps. Anyhow, one enzyme digestion on insert and backbone cannot guarantee the inserts are right combination and in right direction. So chance of successful will be very small. No matter if the size of inset and backbone. Experiment design must be make sure each step is working and then can continue to the next. Otherwise it only waste money and time. Even money is not yours but it is your time . |
9樓2016-09-15 23:37:42
無(wú)花草
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