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feiadafeng銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
求問“細(xì)胞生存率實(shí)驗(yàn)中抑制劑高濃度下生存率平臺，但細(xì)胞沒死完”的原因 已有1人參與
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想請教一個問題： 本人做改性蛋白質(zhì)對特定細(xì)胞生長的抑制實(shí)驗(yàn)時(高濃度抑制生長)，發(fā)現(xiàn)高濃度下細(xì)胞生存率出現(xiàn)平臺期，但總體抑制率都低于50%。數(shù)據(jù)是S型。 按道理說，高濃度的一個梯度下細(xì)胞生長有區(qū)別，但在數(shù)據(jù)里只體現(xiàn)為了平臺期。實(shí)驗(yàn)是利用Celltiter blue測試的熒光值。 因?yàn)椴缓冒l(fā)圖，就如下所示給出了大致曲線走勢�？v軸熒光值。橫軸蛋白質(zhì)濃度。 ---------x x x-------------------------------------------100% x x x x x ---------------------------------------------------------- 0% |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
feiadafeng: 金幣+10, ★有幫助 2016-09-12 14:51:48
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
feiadafeng: 金幣+10, ★有幫助 2016-09-12 14:51:48
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做藥物研發(fā)有5年多了，藥物在高濃度出現(xiàn)平臺期，有幾個可能： 題主你的結(jié)論需要確定：細(xì)胞沒死完，是通過在高濃度時通過信號進(jìn)入平臺期得出的，還是通過顯微鏡觀察出來的？ 如果是通過顯微鏡觀察得出的，很有可能是該蛋白藥物對特定細(xì)胞的抑制作用只是有限的抑制作用，這個現(xiàn)象是存在的。 如果是通過信號進(jìn)入平臺期得出的，這個結(jié)論是有待商榷的，下面是高濃度時通過信號進(jìn)入平臺期的另一種解釋： 熒光信號高濃度時進(jìn)入平臺期，這個熒光信號值是背景值，藥物已經(jīng)起到了100%的抑制作用，題主需要更改抑制率的計算公式。  熒光方法進(jìn)行檢測的原理是： 儀器提供一個特定波長的外源光激發(fā)熒光基團(tuán)，熒光基團(tuán)受到刺激后發(fā)射出另一個波長較激發(fā)光較大的發(fā)射光，該發(fā)射光被儀器捕捉到，轉(zhuǎn)換為電信號值。 值得注意的是無論是激發(fā)波長，還是發(fā)射波長均是有一定的帶寬，兩個之間會有一定的重疊區(qū)域，也就是說儀器提供的發(fā)射光有一部分會被當(dāng)做激發(fā)光捕捉到，這部分光就是背景值，演示圖見附件 熒光光譜.jpg |
2樓2016-09-11 22:39:07
feiadafeng
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首先感謝你的答復(fù)！ *是通過信號進(jìn)入平臺期確定的。這個100%細(xì)胞生存的熒光值是320000左右，背景(不含細(xì)胞的培養(yǎng)基)是170000左右，但是最高濃度的蛋白質(zhì)加入后熒光值是260000左右。所以才會有上述問題。這個試劑是Promega提供的一種試劑，利用酶標(biāo)儀測的560激發(fā)590發(fā)射，所以我認(rèn)為不像共聚焦顯微鏡可能存在熒光信號串通道的問題。 *具體實(shí)驗(yàn)操作是5000細(xì)胞每孔接種的同時按梯度加入蛋白質(zhì)溶液。培養(yǎng)46到72小時，加入celltiter blue試劑，孵育1小時后酶標(biāo)儀測熒光。 *還有一個問題，請問前輩的藥物研發(fā)主要涉及的是小分子還是有跟蛋白質(zhì)相關(guān)？因?yàn)槲腋杏X對于小分子藥物來說，可能在特定高濃度下細(xì)胞生存率會驟減至0，但是對于蛋白質(zhì)溶液來說，會不會出現(xiàn)高濃度并不會徹底殺死細(xì)胞？ |
3樓2016-09-12 14:50:30
yyy0305
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【答案】應(yīng)助回帖
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feiadafeng: 金幣+5, ★★★很有幫助 2016-09-12 23:01:40
feiadafeng: 金幣+5, ★★★很有幫助 2016-09-12 23:01:40
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首先需要肯定的是你有自主的判斷和作出假設(shè)的能力，不論最后結(jié)果怎么樣，結(jié)果總會使人印象深刻的。我也是這么過來的。關(guān)于你后面的提問，我簡單回答下： 我做3年的小分子藥物篩選，1年多的抗體藥物質(zhì)量控制。關(guān)于celltiter blue，你可以找份說明書看看，國外的試劑有個好處，他們的試劑的說明書都比較詳細(xì)全面，很多時候我覺得是在賣方法，說明書上有celltiter blue的核心成分氧化前后的激發(fā)和發(fā)射光譜，30nm的波長間隔不足以讓儀器全面的屏蔽激發(fā)波長，同時celltiter blue的核心成分未被轉(zhuǎn)換也可能提供一部分信號值，背景是肯定存在的。建議你的陰性背景設(shè)置為培養(yǎng)基+高濃度的蛋白藥物，看看信號有沒有變化趨勢，高濃度的蛋白可能會貢獻(xiàn)一部分信號值。 小分子藥物如果用熒光檢測也不會降到0，除非你用的是吸光度法如用MTT,CCK8之類的檢測。小分子濃度過高，也有假陽性/假陰性的情況出現(xiàn)。如小分子有毒性（對所有細(xì)胞一致的殺傷作用），高濃度殺死細(xì)胞，這并不意味著該藥物有效，這是假陽性。小分子類似于熒光基團(tuán)，在560激發(fā)，590發(fā)射，細(xì)胞死光了，信號值依舊很高（假陰性）。 不論小分子還是大分子，都會存在部分有效地情況，不然也不會出現(xiàn)耐藥性之類的問題了。眼見為實(shí)，無論什么檢測方法都是間接的，多年的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷告訴我，信號會欺騙你，只是看騙到什么程度了。 |
4樓2016-09-12 19:34:38
feiadafeng
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5樓2016-09-12 23:01:52
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