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雙向電泳實(shí)驗
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雙向電泳（twodimentionlal gel electrophoresis, 2-DE ) 技術(shù)，特別是以固相 pH 梯度等電聚焦為第一向的雙向電泳技術(shù)是當(dāng)前分辨率最高，信息量最大的電泳技術(shù)。 試劑、試劑盒：尿素去污劑 儀器、耗材：聚丙烯酰胺凝膠 實(shí)驗步驟 一、第一向 1.等電聚焦凝膠的準(zhǔn)備 雙向電泳通常用聚丙烯酰胺凝膠作介質(zhì)，但需含有 8 mol/L 尿素、0.5%~2% 非離子或兩性離子去污劑。為了增加樣品的可溶性，可加 0.5% CHAPS。在第一向電泳中，最重要的是用載體兩性電解質(zhì)建立 pH 梯度。如 “載體兩性電解質(zhì) pH 梯度等電聚焦” 所述混合不同 pH 范圍的載體兩性電解質(zhì)或使用預(yù)混合的載體兩性電解質(zhì)可以增加第一向電泳的分辨率。 O'Farrell 的 ISO-DALT 系統(tǒng)的第一向是用管狀凝膠，雖然也能得到高分辨，且上樣量大，對鹽的耐受量也大，但會由于電內(nèi)滲效應(yīng)丟失堿性蛋白。平板等電聚焦時電極只與凝膠的邊緣接觸，電解體積小，陰極漂移小。相對來說不易丟失蛋白。將薄層凝膠聚合在支持膜上更能得到好的結(jié)果。 含有尿素、離子去污劑和載體兩性電解質(zhì)的凝膠聚合方法請參閱 “載體兩性電解質(zhì) pH 梯度等電聚焦”。 2. 樣品準(zhǔn)備和加樣 可溶蛋白的樣品，如體液，細(xì)胞和組織的萃取液能直接用于雙向電泳，但應(yīng)稀釋到合適的濃度。固體樣品，如組織，細(xì)胞或在組織培養(yǎng)液中的細(xì)胞，加樣前應(yīng)先破碎，研磨和溶解。通常使用的溶解液是 O'Farrell 提出的 9 mol/L 尿素和 2% ( W/V）非離子去污劑（NP-40 或 Triton X-100 )。但對有些蛋白，如組蛋白、核糖體蛋白和膜蛋白的溶解仍然是困難的，必須做適當(dāng)處理。 使用管狀凝膠和垂直平板凝膠時，樣品被加在濃縮膠的頂上，靠近電極容易引起蛋白的變化，水平電泳可加在凝膠的合適位置。有關(guān)樣品的溶解、加樣方法、加樣量等請參閱 “載體兩性電解質(zhì) pH 梯度等電聚焦”。 3. 等電聚焦 等電聚焦的方法同 “載體兩性電解質(zhì) pH 梯度等電聚焦”。由于雙向電泳用的第一向凝膠和樣品中含有尿素和去污劑，聚焦時的溫度應(yīng)稍高于通常用的溫度，如 15~20℃，以防止尿素結(jié)晶。如在凝膠上覆蓋一層膜，也可以防止尿素結(jié)晶，并克服大氣中二氧化碳的影響。由于尿素使蛋白變性，會增加蛋白分子的直徑。鑒于以上一些原因， 應(yīng)使用新鮮樣品和凝膠，并適當(dāng)降低電壓和增加聚焦時間。 4. pH 梯度的測定 如采用表面電極進(jìn)行測量，由于尿素和溫度對 pH 的影響，應(yīng)使用校正因子，請參閱 “載體兩性電解質(zhì) pH 梯度等電聚焦” 的有關(guān)章節(jié)。 另一種方法是用蛋白標(biāo)準(zhǔn)作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。常用的等電點(diǎn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)不能用于雙向分析，因為電泳條件不同。雙向電泳的標(biāo)準(zhǔn)是選擇一些合適的蛋白，在有尿素時加熱不同時間得到的，最終在雙向凝膠上呈現(xiàn)以一定 pH 單位間隔排列的點(diǎn)，點(diǎn)的數(shù)目取決于蛋白質(zhì)氨基酸的組成。 5. 平衡 第二向 SDS 電泳前，將等電聚焦凝膠按樣品泳道剪成膠條，用含有 SDS，在還原條件下的 pH 8.8 Tris 緩沖液平衡。目的是使蛋白質(zhì)分子與 SDS 和還原試劑充分相互作用，解聚蛋白質(zhì)分子，并與 SDS 結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS 膠束，以確保第二向的遷移。平衡時間是很重要的因素。柱狀膠約需 30~40 分鐘，薄層膠（0.5~1 mm ) 約需 5~10 分鐘，超薄膠只需 1~2 分鐘。 二、第二向 1. SDS 凝膠的準(zhǔn)備 請參閱 “SDS 聚丙酰胺凝膠電泳” 各種不連續(xù) SDS 凝膠灌注方法。 2. 二向間的轉(zhuǎn)移 平衡后的等電聚焦凝膠條與 SDS 凝膠的良好接觸是雙向電泳結(jié)果的保證。管狀凝膠的轉(zhuǎn)移需要用瓊脂糖密封，但瓊脂糖中的不純物在銀染時會顯現(xiàn)斑點(diǎn)。如用快速丙烯酰胺聚合的方法，聚合過程中產(chǎn)生的熱會使蛋白變性。 垂直平板電泳時凝膠間的轉(zhuǎn)移可以直接放置，但要防止膠條被拉長，否則蛋白帶會歪斜而使雙向電泳譜畸變。薄層水平電泳間的轉(zhuǎn)移比較容易，因為凝膠聚合在支持膜上，只要將等電聚焦凝膠的膠面向下，貼于 SDS 凝膠上，避免氣泡陷入即可。為了以后分子質(zhì)量的測定，在 SDS 凝膠的一端應(yīng)加分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)。 3. SDS 電泳 請參閱 “SDS 聚丙酰胺凝膠電泳” SDS 電泳的方法。 4. 檢測 考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色、熒光標(biāo)記、放射自顯影等檢測方法請參閱 “常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳” 和 “SDS 聚丙酰胺凝膠電泳”。由于雙向電泳的高分辨率，分離的蛋白斑點(diǎn)無法用肉眼來比較和辨別，應(yīng)該用凝膠掃描或攝錄系統(tǒng)將數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 |
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