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joeming123銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
RNA提取完，直接PCR，總是有條帶、 怎么解？ 已有3人參與
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問題： 用熱酚法提取大腸桿菌RNA， 電泳顯示有基因組污染， 然后進(jìn)行Dnase I酶消解，跑電泳，無基因組條帶， 取10ng消解后的RNA，用大腸桿菌16s引物直接PCR。 有很亮的條帶？ 然后，將消解后的RNA抽提，繼續(xù)用DNae I消解， 做PCR，還是有亮帶。 有人遇到這種問題么？ 怎么解怎么破？  |
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joeming123: 金幣+10, ★★★很有幫助 2016-09-19 15:02:38
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-09-20 08:34:56
joeming123: 金幣+10, ★★★很有幫助 2016-09-19 15:02:38
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-09-20 08:34:56
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請問樓主用的是否是大腸桿菌16srDNA通用引物？樓主用的什么酶進(jìn)行的擴(kuò)增？ 有木有可能是如下原因： 1.16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中。 2.部分Taq酶在擴(kuò)增過程中，允許模板中含有dUTP。 由此得出： 樓主獲得的片段其實(shí)就是以RNA為模板擴(kuò)增得到的條帶。 建議： 1.換用高保真酶，如KOD-Plus等，不能以含dUTP的模板擴(kuò)增的酶，再試試。 2.設(shè)置陽性對照，以大腸桿菌gDNA為模板，高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。 3.將RNA樣品取少量，用RNA酶處理后再用原來的酶擴(kuò)增，看條帶是否還存在。 |
4樓2016-09-19 14:10:44
懶蛋
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8樓2016-09-20 08:47:01
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擴(kuò)增片段多長 如果不長 taq酶也有定的逆轉(zhuǎn)錄功能 所以短片段在未逆轉(zhuǎn)錄的情況下也能擴(kuò)出 只不過效率會低點(diǎn) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-09-20 08:53:01
kuaile5420
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2樓2016-09-14 19:49:46
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3樓2016-09-18 16:06:25
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5樓2016-09-19 15:04:55
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【答案】應(yīng)助回帖
xn8008: 歡迎發(fā)帖交流 2016-09-20 08:35:15
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DNaseⅠ是一種內(nèi)切酶，鎂離子存在條件下，DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn);二價(jià)錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。因此其消解效率與dna是環(huán)狀與否關(guān)系不大，比如，常用限制性內(nèi)切酶可以用于基因組酶切，也可將環(huán)狀質(zhì)粒線性化。建議樓主可以取少量的質(zhì)粒dna做一個(gè)對照實(shí)驗(yàn)，消解后電泳，看環(huán)狀質(zhì)粒是否還存在。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-09-19 23:02:19
7樓2016-09-20 08:27:14
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10樓2016-09-20 13:41:44
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