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dehong1573

至尊木蟲 (正式寫手)

【答案】應(yīng)助回帖


西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-09-22 22:22:16
和質(zhì)?截悢(shù)有關(guān)系,確定你的質(zhì)粒是不是低拷貝的~夠用即可,沒必要糾結(jié)
科學(xué)永無(wú)止境,只有合作共享才能更好地……
11樓2016-09-21 08:49:48
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中士

銅蟲 (初入文壇)


【答案】應(yīng)助回帖


西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-09-22 22:21:17
如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì);虼笥10kb的大質(zhì)粒,應(yīng)加大菌體使用量。溶液Eluent應(yīng)在65℃水浴預(yù)熱,在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。最后洗脫時(shí)可加無(wú)水乙醇。
12樓2016-09-21 09:40:09
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匿名

用戶注銷 (著名寫手)


西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-09-22 22:22:37
本帖僅樓主可見
13樓2016-09-22 22:16:47
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特洛克

新蟲 (初入文壇)


【答案】應(yīng)助回帖

質(zhì)粒提取,不但困擾了好些新手,而且不少老手提取質(zhì)粒也不穩(wěn)定。
影響質(zhì)粒產(chǎn)量的因素很多,現(xiàn)列舉部分,望同道中人完善。

1、質(zhì)粒本身:高拷貝還是低拷貝,影響特別大。低拷貝的特定質(zhì)?梢钥紤]加氯霉素提高拷貝數(shù)(建議先了解氯霉素提高質(zhì)?截悢(shù)的原理,應(yīng)該不是所有的都有效,可能起到相反效果)。
2. 宿主菌:常用的DH5α等,有利于得到高產(chǎn)量的質(zhì)粒。另外一些菌種效果可能差很多(同一實(shí)驗(yàn)室用相同菌種,若別人得率高,應(yīng)該可以排除這個(gè)原因)。
3. 搖菌時(shí)間:這個(gè)影響非常大!有一些實(shí)驗(yàn)者在這方面做得很不好。建議搖菌12-16小時(shí),時(shí)間過短,單個(gè)菌體中的質(zhì)?截悢(shù)會(huì)低很多!時(shí)間過長(zhǎng),當(dāng)心細(xì)菌可能死亡,導(dǎo)致基因組污染等問題。特殊菌種、特殊搖菌溫度,時(shí)間需另行把握。
4. 搖菌用容器大。哼@個(gè)影響也是比較大的。搖150ml的菌液,應(yīng)該用500ml以上的搖菌瓶,效果比250ml或以下的要好;驹瓌t是搖菌容器的體積是菌液體積的4倍或以上。
5. 菌種來(lái)源:新轉(zhuǎn)化的菌種比凍存菌液要好。
6. 培養(yǎng)基:應(yīng)該用高品質(zhì)新配置的培養(yǎng)基。
7. 菌液用量:恰當(dāng)最好,寧少勿多。必須確保充分裂解,否則產(chǎn)量和純度會(huì)顯著降低。
8. 質(zhì)粒提取試劑盒的因素:現(xiàn)在市場(chǎng)上質(zhì)粒提取試劑盒很多,魚龍混雜。好些號(hào)稱高產(chǎn)、高純度無(wú)內(nèi)毒素大提,實(shí)際產(chǎn)量和純度堪憂。OD260判斷濃度、OD260/OD280和OD260/OD230比值判斷純度,很多時(shí)候并不客觀。好些情況下,雜質(zhì)含量高,OD260、280、230差不多按比例升高,比值好并不代表純度就一定好、建議進(jìn)一步瓊脂糖膠電泳。(同一實(shí)驗(yàn)同一試劑盒,可排除這方面因素)。
9. 其它因素:待大家補(bǔ)充。
14樓2016-09-27 17:46:58
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特洛克

新蟲 (初入文壇)


另外,質(zhì)粒大小對(duì)產(chǎn)量影響也很大,過大的質(zhì)粒,產(chǎn)量一般會(huì)有不同程度的降低。
15樓2016-09-27 18:58:55
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lishuaiguang

新蟲 (初入文壇)

引用回帖:
4樓: Originally posted by 010308Jing at 2016-09-18 11:55:55
其實(shí)這個(gè)跟質(zhì)粒還是有關(guān)系的,你保留點(diǎn)之前的菌液直接擴(kuò)大會(huì)比重新挑克隆好很多

我想用之前轉(zhuǎn)化得到的單克隆,先活化培養(yǎng)再擴(kuò)大,不知道行不行
16樓2016-09-27 19:53:41
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Gengli0909

新蟲 (初入文壇)

引用回帖:
1樓: Originally posted by 熊貓愛吃竹子 at 2016-09-16 16:50:46
用thermo的試劑盒從150ml菌液中提質(zhì)粒,最后用nano測(cè)只有200多ng/ml,別人一般都能提到900ng/ml左右,請(qǐng)問一下有什么需要注意的地方嗎,在操作過程中?謝謝

多次上柱收集

發(fā)自小木蟲Android客戶端
17樓2016-10-20 23:24:33
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wilwis

新蟲 (初入文壇)

引用回帖:
13樓: Originally posted by pf790352975 at 2016-09-22 22:16:47
你的質(zhì)粒濃度單位搞錯(cuò)了,應(yīng)該是200多ng/ul    假如你濃度測(cè)定沒問題的話 ,應(yīng)該是提取的問題,不知道你是高拷貝質(zhì)粒還是低拷貝質(zhì)粒,濃度應(yīng)該至少在1ug/ul

至少在1ug/ul。。。。  請(qǐng)問,你用的哪種試劑盒,最近也一直在提高質(zhì)粒濃度,只有七八百ug的樣子
18樓2017-11-28 20:19:06
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