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熊貓愛吃竹子新蟲 (小有名氣)
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大提質(zhì)粒時(shí)如何提高質(zhì)粒濃度？ 已有7人參與
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用thermo的試劑盒從150ml菌液中提質(zhì)粒，最后用nano測只有200多ng/ml，別人一般都能提到900ng/ml左右，請問一下有什么需要注意的地方嗎，在操作過程中？謝謝 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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13樓2016-09-22 22:16:47
【答案】應(yīng)助回帖
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質(zhì)粒提取，不但困擾了好些新手，而且不少老手提取質(zhì)粒也不穩(wěn)定。 影響質(zhì)粒產(chǎn)量的因素很多，現(xiàn)列舉部分，望同道中人完善。 1、質(zhì)粒本身：高拷貝還是低拷貝，影響特別大。低拷貝的特定質(zhì)�？梢钥紤]加氯霉素提高拷貝數(shù)（建議先了解氯霉素提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的原理，應(yīng)該不是所有的都有效，可能起到相反效果）。 2. 宿主菌：常用的DH5α等，有利于得到高產(chǎn)量的質(zhì)粒。另外一些菌種效果可能差很多（同一實(shí)驗(yàn)室用相同菌種，若別人得率高，應(yīng)該可以排除這個(gè)原因）。 3. 搖菌時(shí)間：這個(gè)影響非常大！有一些實(shí)驗(yàn)者在這方面做得很不好。建議搖菌12-16小時(shí)，時(shí)間過短，單個(gè)菌體中的質(zhì)�？截悢�(shù)會(huì)低很多！時(shí)間過長，當(dāng)心細(xì)菌可能死亡，導(dǎo)致基因組污染等問題。特殊菌種、特殊搖菌溫度，時(shí)間需另行把握。 4. 搖菌用容器大�。哼@個(gè)影響也是比較大的。搖150ml的菌液，應(yīng)該用500ml以上的搖菌瓶，效果比250ml或以下的要好�；驹瓌t是搖菌容器的體積是菌液體積的4倍或以上。 5. 菌種來源：新轉(zhuǎn)化的菌種比凍存菌液要好。 6. 培養(yǎng)基：應(yīng)該用高品質(zhì)新配置的培養(yǎng)基。 7. 菌液用量：恰當(dāng)最好，寧少勿多。必須確保充分裂解，否則產(chǎn)量和純度會(huì)顯著降低。 8. 質(zhì)粒提取試劑盒的因素：現(xiàn)在市場上質(zhì)粒提取試劑盒很多，魚龍混雜。好些號(hào)稱高產(chǎn)、高純度無內(nèi)毒素大提，實(shí)際產(chǎn)量和純度堪憂。OD260判斷濃度、OD260/OD280和OD260/OD230比值判斷純度，很多時(shí)候并不客觀。好些情況下，雜質(zhì)含量高，OD260、280、230差不多按比例升高，比值好并不代表純度就一定好、建議進(jìn)一步瓊脂糖膠電泳。（同一實(shí)驗(yàn)同一試劑盒，可排除這方面因素）。 9. 其它因素：待大家補(bǔ)充。 |
14樓2016-09-27 17:46:58
2樓2016-09-18 01:08:51
liling0601
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3樓2016-09-18 11:27:11
010308Jing
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其實(shí)這個(gè)跟質(zhì)粒還是有關(guān)系的，你保留點(diǎn)之前的菌液直接擴(kuò)大會(huì)比重新挑克隆好很多 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-09-18 11:55:55
5樓2016-09-19 22:03:23
rhjilio
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10樓2016-09-20 13:22:09
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