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huojinlong8610金蟲 (小有名氣)
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當(dāng)前器官移植治療疾病面臨的最大問題是供體器官嚴(yán)重缺乏，器官衰竭患者多因無法及時得到供體器官而死亡。異種器官移植已成為目前科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的解決供體器官短缺的有效途徑，豬已被認(rèn)為是最適合的非靈長類異種器官移植供體。豬→人異種器官移植的主要屏障是超急性排斥反應(yīng)（HAR），α1,3半乳糖（α1,3Gal）是引起HAR的主要抗原，臨床上將清除了α1,3Gal的豬器官移植給狒狒，仍會發(fā)生排斥反應(yīng)，提示在豬體內(nèi)還存在其他非α1,3Gal異種抗原。為了早日實現(xiàn)豬→人異種器官移植的臨床應(yīng)用，廣大醫(yī)學(xué)和科研工作者把目光轉(zhuǎn)向了非α1,3Gal基因的挖掘和功能研究。本試驗以獨特的被譽(yù)為豬→人異種器官移植良好供體的BMI為研究材料，以與豬→人異種器官移植免疫排斥反應(yīng)潛在相關(guān)的CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2等5個非α1,3Gal基因為候選基因，從分子、蛋白、細(xì)胞水平同時入手，驗證這5個基因與豬→人異種器官移植免疫排斥反應(yīng)的相關(guān)性。 首先從mRNA水平分離并獲得這些基因的完全編碼區(qū)序列信息，并對這些基因進(jìn)行免疫相關(guān)多組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的qPCR檢測分析，獲得其在mRNA水平的表達(dá)情況；然后采用Western Blot方法進(jìn)一步對相同組織進(jìn)行驗證，獲得其在蛋白水平的表達(dá)情況；構(gòu)建目的基因和綠色熒光報告基因GFP的融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染示蹤進(jìn)行細(xì)胞水平的驗證；并對相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行基本信息、特征信息、結(jié)構(gòu)域、功能位點、高級結(jié)構(gòu)等功能生物信息學(xué)分析。 結(jié)果表明豬CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的全長CDS序列分別為1734 bp、1590 bp、894 bp、861 bp、1509 bp，并提交到GenBank獲得了認(rèn)證。qPCR分析和Western Blot驗證表明CMAH mRNA在頜下腺組織中表達(dá)最高；OXSR1 mRNA在睪丸中表達(dá)最高；CD80 mRNA在脾組織中表達(dá)最高；ASGR1 mRNA在肝臟中特異表達(dá)，在其它組織中不表達(dá)；B4GALNT2 mRNA在扁桃體中表達(dá)最高；揭示同一基因在不同組織和不同基因在相同組織中差異表達(dá)的現(xiàn)象，也說明基因主要在哪些組織發(fā)揮重要的功能，這些重要組織將是我們進(jìn)一步研究該基因功能以及進(jìn)行基因敲除和基因修飾研究的靶組織。構(gòu)建了CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因和綠色熒光蛋白AcGFP1真核融合表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染豬腎上皮PK15細(xì)胞進(jìn)行瞬時表達(dá)，均檢測到了綠色熒光表達(dá)。在此基礎(chǔ)上為了研究這些豬的基因與人免疫排斥反應(yīng)的相關(guān)性，將這些真核融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC進(jìn)行表達(dá)，均檢測到了穩(wěn)定表達(dá)的綠色熒光，表明CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因與豬→人異種器官免疫排斥反應(yīng)相關(guān)。為這些基因在豬→人異種移植排斥反應(yīng)中分子機(jī)制的闡明奠定了基礎(chǔ)。 為深入了解基因編碼的蛋白質(zhì)的相關(guān)功能性質(zhì)，我們對相應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能生物信息學(xué)分析，包括分析其氨基酸組成、分子式、分子量、等電點、消光系數(shù)、半衰期、原子組成、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)、親水系數(shù)等蛋白質(zhì)基本信息；疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋、信號肽、固有無序性、亮氨酸富集的核輸出信號、亞細(xì)胞定位等蛋白質(zhì)的特征信息；結(jié)構(gòu)域和功能位點（磷酸化和糖基化）；二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等。這些蛋白質(zhì)的基本信息、特征信息、結(jié)構(gòu)域、功能位點以及高級結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析為CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 5個蛋白質(zhì)的進(jìn)一步功能研究和驗證提供了理論依據(jù)，也為下一步進(jìn)行豬→人異種器官免疫排斥反應(yīng)相關(guān)基因的聯(lián)合敲除和基因修飾奠定了實驗和臨床試驗基礎(chǔ)。 本研究填補(bǔ)了CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因在豬→人異種器官移植非超急性排斥反應(yīng)α1,3Gal基因研究之外的空白，本研究結(jié)果不僅可為BMI豬→人異種器官移植利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料，同時為促進(jìn)其開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，也可以為豬→人異種器官的早日實現(xiàn)奠定理論和實驗基礎(chǔ)。 |
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當(dāng)前 器官移植 治療 疾病 面臨的 最大問題是 供體器官 嚴(yán)重缺乏，器官衰竭患者 多因 無法 及時得到供體器官 而死亡。異種器官移植 已成為 目前 科學(xué)界 和 醫(yī)學(xué)界 公認(rèn)的 解決 供體器官短缺的 有效途徑，豬 已被認(rèn)為 是最適合的 非靈長類 異種器官移植 供體。豬→人 異種器官移植 的 主要屏障 是 超急性排斥反應(yīng)（HAR），α1,3半乳糖（α1,3Gal）是 引起 HAR的 主要抗原，臨床上 將 清除了α1,3 Gal 的 豬器官 移植給 狒狒，仍會發(fā)生 排斥反應(yīng)，提示 在 豬體內(nèi) 還存在 其他非 α1,3Gal 異種抗原。為了早日 實現(xiàn) 豬→人異種器官移植的 臨床應(yīng)用，廣大醫(yī)學(xué) 和 科研工作者 把目光 轉(zhuǎn)向了非 α1,3Gal 基因的 挖掘 和 功能 研究。本試驗以 獨特的 被譽(yù)為 豬→人異種器官移植 良好供體 的BMI 為 研究材料，以與 豬→人異種器官移植 免疫排斥反應(yīng) 潛在 相關(guān)的 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 等5個 非α1,3Gal基因 為候選基因，從分子、蛋白、細(xì)胞水平 同時 入手，驗證這 5個基因 與豬→人異種器官移植 免疫排斥 反應(yīng)的 相關(guān)性。 Currently, the most significant problem which is encountered by organ transplantation-based treatment of disease is the serious lack of donor organ, therefore most organ failure patients die from not obtaining donor organs timely. On this basis, xenotransplantation has become a well recognized method in scientific and medical community to solve the lack of donor organs, where pig has been regarded as the most suitable on human primate donor for xenotransplantation. The major technique barrier for pig→human xenotransplantation is the hyperacute rejection（HAR）, in which α1,3 galactose（α1,3Gal）is the major antigen that causes HAR. In clinical practice, pig organs in which the α1,3 Gal have been removed, rejection action may still occur, indicating that there are still other heteroantigens other than α1,3Gal. To realize clinical application of pig→human xenotransplantation, massive medical and scientific researchers turn to the exploration of non-α1,3Gal gene and research of related functions. In this experiment, the unique material BMI, known as an excellent donor for pig→human xenotransplantation, was selected as the researched material, and 5 non-α1,3Gal genes that are related with pig→human xenotransplantation rejection reaction such as CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1 and B4GALNT were selected as candidate genes. The correlation between the 5 genes and pig→human xenotransplantation rejection reaction were verifed in the molecular, protein, and cellular level simultaneously. 首先 從mRNA水平分離 并 獲得 這些 基因的 完全編碼區(qū) 序列信息，并對 這些 基因 進(jìn)行 免疫相關(guān) 多組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 的qPCR 檢測分析，獲得 其 在mRNA水平的 表達(dá)情況；然后 采用Western Blot方法 進(jìn)一步 對 相同組織 進(jìn)行驗證，獲得 其在 蛋白水平的 表達(dá)情況；構(gòu)建 目的基因 和 綠色熒光報告基因 GFP 的 融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染示蹤 進(jìn)行 細(xì)胞水平的 驗證；并對 相關(guān)蛋白質(zhì) 進(jìn)行 基本信息、特征信息、結(jié)構(gòu)域、功能位點、高級結(jié)構(gòu) 等功能生物信息學(xué) 分析。 First,mRNA-level separation was conducted to obtain the serial information of these genes in full coding region, qPCR detection analysis in the level of immuno-related multi-org transcription expression was applied to obtain the expression condition in mRNA level; secondly, Western Blot was adopted to further verify the same organs, so as to obtain the expression condition in protein level; the fusion expression vector for target gene and Green fluorescent protein reporter gene (GFP) was established for transfection tracing, so as to perform cellular level verification; moreover, the functional biological information of related proteins were analyzed including basic information, characteristic information, structural domain, functional site, and higher-order structure. 結(jié)果表明 豬CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1 和 B4GALNT2 基因的 全長CDS序列 分別為 1734 bp、1590 bp、894 bp、861 bp、1509 bp，并 提交到 GenBank 獲得了 認(rèn)證。qPCR分析 和 Western Blot驗證 表明CMAH mRNA在 頜下腺組織中 表達(dá) 最高；OXSR1 mRNA在 睪丸中 表達(dá)最高；CD80 mRNA在 脾組織中 表達(dá)最高；ASGR1 mRNA在 肝臟中 特異表達(dá)，在其它組織中 不表達(dá)；B4GALNT2 mRNA在 扁桃體中 表達(dá)最高；揭示 同一基因 在不同組織 和 不同基因 在 相同組織中 差異表達(dá) 的現(xiàn)象，也說明 基因 主要在 哪些組織 發(fā)揮 重要的功能，這些 重要組織 將是 我們 進(jìn)一步 研究 該基因功能 以及 進(jìn)行 基因敲除 和 基因修飾 研究的 靶組織。構(gòu)建了 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因 和 綠色熒光蛋白AcGFP1 真核 融合表達(dá)載體 并 將其 轉(zhuǎn)染 豬腎上皮PK15細(xì)胞 進(jìn)行 瞬時表達(dá)，均 檢測到了 綠色熒光表達(dá)。在此基礎(chǔ)上 為了 研究 這些 豬的基因 與 人免疫排斥反應(yīng)的 相關(guān)性，將這些 真核融合表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 進(jìn)行 表達(dá)，均檢測到了 穩(wěn)定表達(dá)的 綠色熒光，表明 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因 與 豬→人異種器官免疫排斥反應(yīng) 相關(guān)。為 這些 基因在 豬→人異種移植排 斥反應(yīng)中 分子機(jī)制 的 闡明奠定了 基礎(chǔ)。 Result showed that the full-length CDS sequences of pig CMAH, OXSR1, CD80, ASGR1 and B4GALNT2 genes were 1734 bp, 1590 bp, 894 bp, 861 bp, and 1509 bp, respectively. This result was submitted to GenBank and verification was realized. qPCR analysis and Western Blot verification showed that CMAH mRNA achieved the highest expression in submandibular gland tissue; OXSR1 mRNA achieved the highest expression in testis；CD80 mRNA achieved the highest expression in the tissue of spleen；ASGR1 mRNA achieved specific expression in liver, which achieved no expression in other tissues；B4GALNT2 mRNA achieved the highest expression in tonsilla；moreover it also revealed the phenomena of differential expression under the conditions of the same gene in different tissues as well as different genes in the same tissue. It also showed the tissues in which these genes mainly exerted significant functions, which will be regarded as target tissues for gene function research and gene knockout and modification research. In this work, we established the eukaryotic fusion expression vectors for gene CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1, B4GALNT2 respectively and green fluorescent protein AcGFP1 and then transfected it to pig kidney epithelial cell PK15 for transient expression, and green fluorescence expression was detected. On this basis, to research the correlation between these pig genes and human immunological rejection reaction, these eukaryotic fusion expression vectors were transfected to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) for expression, and the stably expressed green fluorescence can be detected, indicating that the pig genes of CMAH, OXSR1, CD80, ASGR1 and B4GALNT2 are related with pig→human xenotransplantation rejection reaction. This experiment lays a foundation for illustrating the molecular mechanism in pig→human xenotransplantation rejection reaction. 為深入了解 基因編碼的 蛋白質(zhì)的 相關(guān)功能性質(zhì)，我們 對相應(yīng)蛋白質(zhì) 進(jìn)行了 功能生物信息學(xué)分析，包括 分析 其 氨基酸組成、分子式、分子量、等電點、消光系數(shù)、半衰期、原子組成、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)、親水系數(shù) 等蛋白質(zhì) 基本信息；疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋、信號肽、固有無序性、亮氨酸富集的 核輸出信號、亞細(xì)胞定位 等 蛋白質(zhì)的特征信息；結(jié)構(gòu)域 和 功能位點（磷酸化和糖基化）；二級結(jié)構(gòu) 和 三級結(jié)構(gòu)等。這些蛋白質(zhì)的 基本信息、特征信息、結(jié)構(gòu)域、功能位點 以及 高級結(jié)構(gòu)的 生物信息學(xué)分析 為 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 5個 蛋白質(zhì)的 進(jìn)一步 功能研究 和 驗證 提供了 理論依據(jù)，也為 下一步 進(jìn)行 豬→人異種器官免疫排斥反應(yīng) 相關(guān)基因 的 聯(lián)合敲除 和 基因修飾 奠定了 實驗和臨床試驗 基礎(chǔ)。 In order to graso an in-depth knowledge on functional properties of gene encoding proteins, we analyzed the functional bioinformation of related proteins, including basic informations such as amino acid composition, molecular formula, molecular weight, isoelectric point, extinction coefficient, half-life period, atomic composition, instability coefficient, fat index, and hydrophilic coefficient; characteristic informations such as hydrophobicity, transmembrane structure, coiled coil, signal peptide, inherent disorder, leucine-rich nuclear export signal, and subcellular localization; structural domain and function site (phosphorylation and glycosylation); secondary structure and tertiary structure. All these information provide theoretical basis for further functional research and verification of 5 proteins of CMAH, OXSR1, CD80, ASGR1 and B4GALNT2, and also lay foundation for clinical trails of gene knockout and modification related to pig→human xenotransplantation rejection reactiono in the next stage. 本研究 填補(bǔ)了 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因在 豬→人異種器官移植 非超急性排斥反應(yīng) α1,3Gal基因研究 之外的 空白，本研究結(jié)果 不僅可為 BMI 豬→人異種器官移植 利用 提供 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料，同時為 促進(jìn)其 開發(fā)和利用 提供 科學(xué)依據(jù)，也可以為 豬→人異種器官 的早日實現(xiàn) 奠定理論 和 實驗基礎(chǔ)。 This research fills the blank research area on the correlation between 5 pig genes (CMAH, OXSR1, CD80, ASGR1 and B4GALNT2, other than α1,3Gal gene) and pig→human xenotransplantation non-hyperacute rejection reaction. The research results not only provide basic data material for the application of BMI in pig→human xenotransplantation, but also provides scientific basis for the development and utilization of BMI, more importantly lays theoretical and experimental basis for early realization of pig→human xenotransplantation. |
2樓2016-09-19 19:14:52
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