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小鼠肝細胞原代培養(yǎng)實驗
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實驗方法原理 將小鼠的肝細胞從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。 實驗材料 小鼠 試劑、試劑盒 DMEM無血清DMEM培養(yǎng)基胰酶PBS 儀器、耗材 飯盒紗布剪子鑷子燒杯平皿研磨玻片濾網(wǎng)離心管6孔培養(yǎng)板吸管移液管手套微量加樣器 實驗步驟 一、實驗材料準(zhǔn)備 1. 動物：小鼠。 2. 試劑：DMEM(含血清)、無血清DMEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS。 3. 器械：飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網(wǎng)、離心管(15/50 ml)、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器。 4. 準(zhǔn)備：酒精擦拭臺面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風(fēng)機吹至實驗結(jié)束。 二、方法 1. 將小鼠斷頸致死，置75%酒精泡2-3秒鐘，取肝臟，置于盛有PBS的平皿中。 2. 剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物，轉(zhuǎn)移到另一個盛有PBS液的平皿中。 2.3 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊(大小約1mm2)，玻片研磨，轉(zhuǎn)到離心管，離心(1 000 rpm，5 min)。 4. 視組織或細胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。 5. 加入3-5 ml含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用。 6. 用100目孔徑濾網(wǎng)濾過，除去未消化的大組織塊。 7. 再次離心5 min，棄上清液。 8. 加入無血清培養(yǎng)液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。 9. 加入含血清的培養(yǎng)液1-2 ml(視細胞量)，血球計數(shù)板計數(shù)。 10. 將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)。 |
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