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基因合成實驗
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實驗?zāi)康?/b> 獲得一段特需列的最直接的方法就是化學(xué)合成。本方案是利用成對的寡核苷酸， 通過其3’端的退火而生成一短的雙鏈區(qū)，寡核苷酸既作為模板，又起引物的作用，長達 400 bp 的所需片段通過一步反應(yīng)即可合成。 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒 dNTP DAN聚合酶 乙醇 TE 限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液 儀器、耗材 水浴鍋培養(yǎng)箱 實驗步驟 1. 將兩種寡核苷酸各1 μg加入微量離心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×測序酶緩沖液。70℃加熱5 min，然后在合適的退火溫度下保溫5 min，取2 μl 留待以后的分析。 2. 加2 μl 4種dNTP混合液和10 U測序酶，30℃溫育30 min。 3. 70℃ 10 min 滅活DNA聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。 4. 加10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，加水和20~100 U 的適合于克隆的限制性內(nèi)切酶至100 μl。適當(dāng)?shù)臏囟认孪? h 以上。 5. 酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸銨和400 μl 的無水乙醇，-70℃沉淀15 min，離心5 min，沉淀重懸于100 μl TE緩沖液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗滌沉淀，干燥，20 μl TE緩沖液溶解，取2 μl 用于以后的分析。 6. 用篩分型瓊脂糖凝膠電泳分析確證原材料、延伸產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物，估計延伸的寡核苷酸的量，再用適當(dāng)?shù)妮d體亞克隆。 7. 對幾個合適的亞克隆測序。 |
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