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流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備
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流式細(xì)胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計算機(jī)等高技術(shù)發(fā)展起來的一種先進(jìn)儀器，已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細(xì)胞表面標(biāo)志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細(xì)胞群和亞群進(jìn)行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細(xì)胞。 活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是用于FCM檢測的標(biāo)本準(zhǔn)備，染色后也能在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，在某些實(shí)驗(yàn)條件下，活細(xì)胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結(jié)果。 (一) 原理 活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測定的熒光強(qiáng)度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。 (二) 操作步驟 制備活性高的細(xì)胞懸液(培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106～1×107／ml ↓ 取40μl細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀釋)滅活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min ↓ 棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖 ↓ 4℃ 30min 用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min ↓ 加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察， 視細(xì)胞濃度加入100～500μl固定液) ↓ FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標(biāo)本在試管中可保存5～7天) (三) 試劑和器材 1. 各種特異性單克隆抗體。 2. 熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。 4. 玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。 (四) 注意事項 1. 整個操作在4℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。 2. 洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。 3. 加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。 4. 細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。 附: 1. DPBS (×10, 貯存液) NaCl 80g KCl 2g 蒸餾水加至1000ml Na2HPO4 11.5g 臨用時用蒸餾水1∶10稀釋 KH2PO4 2g 2. 洗滌液 DPBS 900ml FCS 50ml (終濃度 5％) 4％NaN350ml (終濃度0.2％) 3. 固定液 DPBS 1000ml 葡萄糖 20g (終濃度2％) 甲 醛 10ml NaN3 0.2g (終濃度0.02％) |
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