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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 綜合其他 » 重組桿狀病毒的純化實驗
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重組桿狀病毒的純化實驗
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桿狀病毒是一類在自然界中專一性感染節(jié)肢動物的DNA病毒，病毒粒子呈桿狀，基因組為雙鏈環(huán)狀DNA分子，DNA以超螺旋形式壓縮包裝在桿狀衣殼內，大小在90~180 Kb之間。目前桿狀病毒作為高效、安全的無公害生物蟲劑廣泛應用于害蟲防治。 實驗材料 桿狀病毒 試劑、試劑盒 瓊脂、牛血清 儀器、耗材 培養(yǎng)瓶、凍存管 實驗步驟 1. 制備病毒上清的系列稀釋液，該病毒上清獲得自在無血清完全培養(yǎng)液中轉染 pAC360β-gal DNA的細胞。在含150 μg/ml X-gal 的瓊脂糖頂層覆蓋物下病毒形成蝕斑。 2. 當蝕斑形成后，用滅菌巴斯德吸管挑取一個分離較好的藍色蝕斑，并將瓊脂糖塊移入 一支含有1 ml 無血清完全培養(yǎng)液的無菌試管中。在旋渦混合器上劇烈籬蕩，并用無血清完全培養(yǎng)液制備10-1、10-2和10-3的系列稀釋液。 3. 用含150 μg/ml X-gal 的瓊脂糖頂層覆蓋物蝕斑測定病毒（有助于發(fā)現(xiàn)重組子），重復蝕斑試驗，直到獲得純的重組病毒貯液。 4. 用無菌吸管挑取一個純的重組蝕斑，將瓊脂糖塊移入一含2.5×106 Sf9細胞和5 ml 完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）的25 cm2 培養(yǎng)瓶中。于27℃溫育4~5天直到大多數(shù)細胞被感染。 5. 確定病毒滴度（應在5×107~1×108 pfu/ml之間）。 6. 加入1 ml 該毒種貯液于一支1.5 ml 螺口凍存管中，于-80℃可長期保存，于4℃保存剩余的液體（標記為初代毒種液）。從初代毒種液中生產大批病毒貯液并滴定之。 |
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