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用熒光素酶基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟 已有5人參與
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用熒光素酶基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟 哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個(gè)氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí), 熒光素酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。 采用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)GFP（mCherry）和Luciferase2雙標(biāo)記表達(dá)細(xì)胞系，通過2A序列連接GFP（mCherry）和Luciferase2，可同時(shí)等量表達(dá)GFP（mCherry）和Luciferase2，便于體外觀察和體內(nèi)示蹤；mCherry可用于體內(nèi)示蹤，與新一代Luciferase2結(jié)合，可方便的監(jiān)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的生長和變化。 轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過程的描述（慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選）： (一) 質(zhì)粒部分 1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴(kuò)增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。 2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳， TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。 3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。 4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。 5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個(gè)單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。 6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過酶切鑒定。 7.熒光素表達(dá)鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時(shí)后換培養(yǎng)液。 8.報(bào)告基因檢測(cè)：Passive Lysis Agent裂解細(xì)胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。 9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測(cè)正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。 (二) 慢病毒包裝部分 1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天， 293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15μg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。 2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。 3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500μl離心管中，-80℃保存。 (三) 慢病毒感染&篩選 1.感染前一天(Day1)，消化目的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度），37°C過夜孵化細(xì)胞。 2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200μl加入細(xì)胞中。 3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。 4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500μl完全培養(yǎng)基。 5.(Day4)換液，加入300μg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。 6.(Day4－7），每24h換液，300μg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。 維持培養(yǎng)。 7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100μg/mlHygromycin維持培養(yǎng)。 8. 目的細(xì)胞-Gluc/Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。GFP和mCherry表達(dá)通過熒光顯微鏡觀察。 |
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2樓2017-01-19 01:54:36
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老師你好，我也在做這方面的實(shí)驗(yàn)，我想問一下，這個(gè)熒光素酶報(bào)告基因的是用什么儀器檢測(cè)的，可以用酶標(biāo)儀嗎？還是熒光顯微鏡，如果是熒光顯微鏡的話，是普通的就可以還是的用倒置的？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-02-27 22:06:36
leon1593123
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4樓2017-04-15 22:41:29
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老師你好，最近在做腫瘤方面的實(shí)驗(yàn)需要用到這種雙標(biāo)記的質(zhì)粒，不知道老師能否給予，我們也可以購買 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2018-03-30 16:34:35
哈哈哈張杰
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你好，請(qǐng)問stbl3細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，100μl被多少目的DNA飽和呢 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2019-07-24 21:58:53
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