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蛋白質(zhì)檢測(cè)之免疫共沉淀 已有1人參與
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1樓 一、原理： 免疫共沉淀（Co-IP）是以研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，其原理基礎(chǔ)為抗體-抗原之間的專(zhuān)一性作用。在分子病理生物學(xué)研究領(lǐng)域，Co-IP是用以確定兩種蛋白在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的常用方法。其技術(shù)原理為：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)，如果用蛋白質(zhì)N的抗體免疫沉淀N，那么與N在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)M也能沉淀下來(lái)。目前多用于精制的蛋白A預(yù)先結(jié)合固化在瓊脂糖的珠子（Beads）上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的蛋白A就能吸附抗原到精制的目的。Co-IP主要用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的結(jié)合情況，也用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的結(jié)合蛋白。 二、具體步驟： 1. 細(xì)胞用預(yù)冷的PBS液洗滌2次，最后洗滌完成后吸干PBS液。 2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer（1ml/107個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶）。 3. 刮留細(xì)胞：用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中上刮下，將懸液轉(zhuǎn)入1.5mlEP管中，EP管插冰上，置于水平搖床上緩慢晃動(dòng)15min。 4. 4℃，14000g離心15min。 5. 立即將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。 6. 準(zhǔn)備Protein A瓊脂糖，用PBS液洗兩遍珠子，然后用PBS液配制成50%濃度。 *為避免操作中破壞瓊脂糖珠，減掉移液器槍頭的尖部分。 7. 每ml總蛋白中加入100ul Protein A瓊脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平搖床上4℃搖晃10min。 *目的是去除非特異性雜蛋白，可降低背景。 8. 4℃，14000g 離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。 9. 測(cè)定蛋白濃度，可選用Bradford法做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 10. 蛋白定量，分裝，-20℃保存，可保存1個(gè)月。 11. 用PBS液將總蛋白稀釋至約1ug/ml。 12. 加入500ul稀釋好的兔抗到總蛋白中。 13. 于搖床上4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物，可選擇過(guò)夜或室溫放置2h。 加入100ul Protein A瓊脂糖珠用以捕捉抗原抗體復(fù)合物，搖床4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或者室溫孵育1h。 15. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，去上清，收集瓊脂糖珠-抗原抗體的復(fù)合物。 16. 用800ul預(yù)冷RIPA buffer沖洗3遍。 17. 用60ul 2倍上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕敲打混勻。 18. 將上樣樣品煮5min。 19. 14000g離心，收集剩余瓊脂糖珠。 20. 將上清電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。 21. 上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳。 三、優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 1.于天然狀態(tài)下相互作用的蛋白質(zhì)。 2.蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。 3.分離得到相互作用蛋白的天然符合物。 缺點(diǎn)： 1.低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能檢測(cè)不到。 2.兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能有第三者參與，而非直接結(jié)合。 實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)可能的結(jié)合蛋白非常重要，以此選擇最后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身存在風(fēng)險(xiǎn)。 |
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