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如果是想用PCR將基因片段上沒有的33個(gè)堿基補(bǔ)充上去，如何設(shè)計(jì)引物？ 已有6人參與
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求大神幫忙看看，如果是想用PCR將基因片段上沒有的33個(gè)堿基從5’端補(bǔ)充上去，如何設(shè)計(jì)引物？這樣是不是要在原始上游引物上加上33bp？這樣引物是不是要設(shè)計(jì)成五十多bp？這樣可行嗎？謝謝 @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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應(yīng)該是可行的，我做融合PCR的時(shí)候，引物長(zhǎng)度用過46bp，擴(kuò)增沒問題。建議如下： 1.將你的33個(gè)堿基附在引物后面，注意序列正確性，保證讀碼框的正確性。 2.應(yīng)以原始引物的Tm值（不含這33個(gè)堿基）作為參考來設(shè)置退火溫度。 3.引物太長(zhǎng)，有時(shí)候引物自身會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)影響擴(kuò)增效率，可以在擴(kuò)增前處理下引物（如沸水浴變性后立即置冰上）。 4.保證模板的質(zhì)量可提高擴(kuò)增效率，選用質(zhì)量較高的模板，如質(zhì)�；蛘呒兓^的目標(biāo)片段。 |
6樓2016-10-24 15:51:02
小冀-
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34樓2016-10-31 19:07:28
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我覺得可以，就跟高通量測(cè)序需要barcode一樣。 不過，知道前面的序列，為什么不重新設(shè)計(jì)一個(gè)引物呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-10-24 14:04:39
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看到有文獻(xiàn)是說兩個(gè)物種不同，然后人的缺了N端33個(gè)堿基，如果是體外克隆表達(dá)缺了這33個(gè)堿基會(huì)造成活性的降低，所以只能通過這種方法加上去 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-10-24 14:13:35
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我覺得如果有前邊序列信息的話（其他近緣物種也行），重新設(shè)計(jì)比較好。 如果在引物上＋33個(gè)堿基，熔解溫度啥的不好弄了。 別的就不知道啦 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-10-24 14:20:09
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如果是這樣子的話能通過采用其他近緣物種進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，再以我自己這個(gè)物種提取的DNA作為模版擴(kuò)增？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2016-10-24 15:01:50
7樓2016-10-24 16:09:47
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10樓2016-10-25 10:28:34
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