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真菌菌絲的總RNA的提取 已有2人參與
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試劑： RNA提取緩沖液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC處理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亞精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巰基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高溫滅菌條件下，Tris-HCl要和DEPC發(fā)生反應(yīng)，所以配RNA提取緩沖液時(shí)直接用DEPC 處理的水配制即可。 SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA 10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl，加1‰的DEPC過(guò)夜后，高溫滅菌。 3M NaAc 氯仿:異戊醇（24:1） 酚（pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1） DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過(guò)夜，高溫滅菌 無(wú)水乙醇 70%酒精 方法 1. 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱，離心管中加入ME（巰基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。 2.取約0.8g菌絲體（液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了），在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末，裝入50 mL離心管，按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液，顛倒混勻。 3. 65℃水浴3-10 min，期間混勻2-3次 4. 加入等體積的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 5. 取上清，等體積的氯仿:異戊醇（24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 6. 加入1/4V體積10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或過(guò)夜) 7. 10,000 rpm，4℃離心20 min 8. 棄上清，用500 ulSSTE溶解沉淀 9. 酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提兩次，氯仿:異戊醇（24:1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min） 10. 加2V體積的無(wú)水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上 11. 12,000 rpm，4℃離心20 min 12. 棄上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥 13. 加200 ul的DEPC處理水溶解 14. 用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量 （在抽提過(guò)程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù)） 注意：提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短。 |
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