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sunyu65045木蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
請(qǐng)教如何將還原抗體F(ab')2為F（ab'） 已有1人參與
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| 我最近一直在對(duì)抗體進(jìn)行酶切，使用胃蛋白酶進(jìn)行酶切，現(xiàn)在已經(jīng)可以將抗體的Fc段切除，但是在對(duì)F（ab'）2進(jìn)行還原時(shí)一直無(wú)法完成。我具體是這樣操作的：取0.2mg的抗體加入一定的胃蛋白酶，pH 2.6，37攝氏度培養(yǎng)1小時(shí)，HPLC檢測(cè)酶切效果，圖譜顯示酶切完全。將反應(yīng)液pH調(diào)節(jié)到8.0終止酶切反應(yīng)，再加入終濃度為50mM的2-巰基乙胺和終濃度為10mM的EDTA，37攝氏度反應(yīng)90分鐘，HPLC檢驗(yàn)圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有將二價(jià)抗體還原為一價(jià)抗體。延長(zhǎng)此反應(yīng)時(shí)間并沒(méi)有很好地效果，我又使用了DTT對(duì)二價(jià)抗體進(jìn)行還原，結(jié)果DTT將抗體切成很多小片段。請(qǐng)教大家我應(yīng)該怎樣繼續(xù)試驗(yàn)，將抗體還原？謝謝大家了，急啊！ |
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kaobo2012
木蟲(chóng) (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kuaile5420: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-27 21:23:23
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kuaile5420: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-27 21:23:23
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50mM的2-巰基乙胺和終濃度為10mM的EDTA，37攝氏度反應(yīng)90分鐘，HPLC檢驗(yàn)圖譜時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)該沒(méi)有還原劑吧？我理解，會(huì)不會(huì)被打斷的二硫健，又重新結(jié)合在一起了？我以前也做某個(gè)蛋白的還原，是在流動(dòng)相中加了還原劑，但據(jù)說(shuō)還原劑對(duì)色譜柱不好，如果加的話，你可以看看色譜柱說(shuō)明書。 DTT將抗體切碎，我還是第一次聽(tīng)說(shuō)。是不是DTT被蛋白酶什么的污染了？ |
2樓2016-10-27 20:27:43
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