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[求助]
克隆啟動子 已有1人參與
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克隆一個基因的啟動子，大小在2.5K，老是p不出來，用的高保真的酶，引物兩端加了酶切位點(diǎn)，引物沒加酶切位點(diǎn)時NCBI-blast，特異性很好，求大神、同行們幫助，，跪謝??? 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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田生帥菜
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我最近也在做類似實(shí)驗。不過我的序列比較短，純啟動子100bp，算上前面的調(diào)控序列才260，但前面調(diào)控我是合成的，因為都是重復(fù)序列，無法PCR。建議你分段擴(kuò)增，看看短一點(diǎn)能不能擴(kuò)出來，再融合就可以了。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2016-11-07 20:50:42
wangxiaoguo
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是沒加位點(diǎn)是可以擴(kuò)出來，加了位點(diǎn)的引物擴(kuò)不出來？可以看一下引物的匹配性，提高溫度，或者用兩步法試試 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
3樓2016-11-07 23:26:19
寒冰利劍
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先設(shè)計一對不帶酶切位點(diǎn)的引物，要盡可能覆蓋啟動子全長，下游可以結(jié)合在5`utr或cds上，上游盡可能靠前，測序正確后，再以此為模板，加酶切位點(diǎn)精確克隆。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
4樓2016-11-07 23:59:45
5樓2016-11-08 12:26:57
送紅花一朵 |
我沒有合沒有酶切位點(diǎn)的引物，只是blast了一下。那么我是不是可以以沒有酶切位點(diǎn)的引物p出來的片段為模板，用帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行下一步擴(kuò)增呢 ？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-11-08 12:29:05
7樓2016-11-08 12:30:24
田生帥菜
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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融合非常簡單，沒做過的不一定就難做，你了解一下，其實(shí)很簡單。如果你覺得條帶不對，其實(shí)就是你自己都認(rèn)為你沒有擴(kuò)出來。是不？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
8樓2016-11-08 12:31:41
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10樓2016-11-08 12:34:06
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