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人腫瘤抗原的識(shí)別與鑒定實(shí)驗(yàn)
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實(shí)驗(yàn)材料 腫瘤細(xì)胞 試劑、試劑盒 PBS、生理鹽水、裂解液、蛋白酶抑制劑 儀器、耗材 培養(yǎng)瓶、細(xì)胞刮棒、離心管、低溫離心機(jī)、-80℃冰箱、探針型超聲波、恒溫水浴鍋 實(shí)驗(yàn)步驟 一、 裂解細(xì)胞 1. 方向刮取細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，離心取沉淀，-80℃ 保存。（收集細(xì)胞要迅速，低溫下進(jìn)行，以減弱蛋白酶的作用） 2. 裂解細(xì)胞。采用RIPA 裂解體系，使用前40℃ 預(yù)冷，按107 個(gè)細(xì)胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混勻，加入適量的蛋白酶抑制劑 （如cocktail）， 冰上放置3~5 分鐘。 3. 超聲處理裂解液。使用探針型超聲進(jìn)行多次適當(dāng)頻率的短促?zèng)_擊，10~20秒/次，重復(fù)3 次，中間間隔10~20 秒，冰浴下進(jìn)行。 4. 15 000 rpm，40℃離心15 min，吸取上清液于另一EP管中，置冰上。上清液用于下一步的預(yù)處理。 二、裂解物的預(yù)處理 使用正常人的血清對(duì)裂解物進(jìn)行預(yù)處理。 1. 按1 ml 裂解物加2 μl 對(duì)照血清的比例加入正常人血清。 2. 室溫孵育2~3 小時(shí)，緩慢搖動(dòng)。 三、免疫復(fù)合物的純化 1. 用Dynabeads protein A 進(jìn)行免疫復(fù)合物的純化。 2. 將Dynabeads protein A 振蕩混勻，吸取100 μl磁珠于EP 管中，置于磁鐵架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。 3. 加500 μl 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管，輕柔搓動(dòng)管子約2~3 min，將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。 4. 重復(fù)2 步驟兩次。 5. 清洗完磁珠后，加500 μl 預(yù)處理后的裂解物，反復(fù)搖動(dòng)管子，室溫下反應(yīng)10~20 min。 6. 將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。 7. 用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。 8. 洗脫抗原-抗體復(fù)合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 μl于Ep 管中，輕柔搓動(dòng)管子約2~3 min，將P管置于磁鐵架上，吸取上清于一EP管。 9. 重復(fù)步驟7，將上清收集于同一個(gè)EP管洗脫樣品總體積為60 μl，作對(duì)照用。 10. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后備用。 11. 在步驟5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 μl 血清），緩慢搖動(dòng)，室溫孵育2~3 h。 12. 將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。 13. 重復(fù)步驟6~8。共收集到兩份樣品，對(duì)照與病人的純化免疫復(fù)合物各60 μl。 14. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱儲(chǔ)液100 μl，40℃ 保存。 15. 在樣品中加入2×SDS 上樣緩沖液并用1 M NaOH 調(diào)節(jié)pH 至使溴酚藍(lán)呈藍(lán)色。 四、結(jié)果分析 1. 1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的樣品可直接進(jìn)行一維凝膠電泳，或者對(duì)磁珠上的蛋白A 或蛋白G 進(jìn)行耦聯(lián)劑修飾，洗脫后的樣品可進(jìn)行Western Blot。 2. RIPA裂解液： 150 mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脫氧膽酸鈉； 0.1%SDS ；50 mmol/L Tris（ pH8.0）。 |
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