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從富含多糖的植物組織中提取和純化 RNA 已有1人參與
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實(shí)驗(yàn)方法原理 硫氰酸胍能溶解細(xì)胞并使蛋白變性. 當(dāng)用于抽提緩沖液時(shí)，可產(chǎn)生無(wú) RNase 的環(huán)境□組織抽提后，以中等轉(zhuǎn)速離心勻漿液，以除去小溶性多搪。用苯酚：氯仿將上清液抽提出，RNA 位于水相，DNA 和蛋白質(zhì)位于苯酚相和 兩相交界面。用乙酸鉀將位于水相的多糖選擇件的沉淀出來(lái)，然后用氯化鋰選擇性地將 RNA 從殘余的污染物中純化出來(lái)。該方法成功地從多種在高濃度 CO2 環(huán)境中生長(zhǎng)的植物中提取了葉片 RNA, 證明了該方法的有效 性。 試劑、試劑盒 0.75mol L檸檬酸鈉 N-月桂肌氨酸(N-lauroyl sarcosine) 硫氰酸胍緩沖液 抽提緩沖液 氯仿 異戊醇 2mol L乙酸鈉 酸性苯酚 異內(nèi)醇 乙醇 2mol L乙酸鉀 10mol L LiCl TNE緩沖液 TE緩沖液 液氮 儀器、耗材 研缽和研杵 離心機(jī) 玻璃 Pasteur 吸量管 實(shí)驗(yàn)步驟 一 材料與設(shè)備 1)0.75mol/L 檸檬酸鈉，pH7.0(含檸檬酸）, 用 0.1�PC 處理并高壓滅菌 2)10%(m/V)N-月桂肌氨酸 (N-lauroyl sarcosine) 3) 硫氰酸胍緩沖液：用 293 ml 無(wú)菌去離子水，17.6 ml0.75mol/L 檸檬酸鈉,26.4m 丨 10%N-十二醇肌氨酸鈉，在廠家藥瓶?jī)?nèi)于溶解 250 g 硫氰酸胍 (不用稱(chēng)重) 4) 抽提緩沖液：每 5 ml 硫氰酸胍緩沖液加 36ul 巰基乙醇。若被提取的組織中含多聚苯酚，抽提緩沖液中則可加入聚乙烯聚吡咯烷酮 (polyvinypoiypyrrolidone)(20%，m/m) 5) 氯仿：異戊醇 49:1(V/V) 6)2mol/L 乙酸鈉，加乙酸至 pH4.0 7) 酸性苯酚:500 g 晶體苯酚溶于 500 mli 離子水中，50 ml 每份于-20℃ 保存，4℃ 可保存一個(gè)月 8) 異內(nèi)醇 9)70% 和 100% 乙醇 10)2mol/L 乙酸鉀，加冰乙酸至 pH4.8 11)10mol/L LiCl 12)TNE 緩沖液：10 mmol/LTris-HCl,PH7.5, 室溫，15 mmol/L,NaCl，1 mmol/LEDTA 13)TE 緩沖液:l0 mmol/LTris-HCL PH7.5 1 mmol/LTEDTA 14) 研缽和研杵 15) 液氮 16) 離心機(jī) 17) 玻璃 Pasteur 吸量管，200℃ 干烤至少 3 h 二 操作方法 1) 在液氮中將 0.4 g 組織研磨為細(xì)粉末，勿讓組織解凍 2) 在研磨過(guò)程中，加入 3.5 ml 抽提緩沖液，充分研磨。將勻漿轉(zhuǎn)移到一個(gè) 10 ml 聚丙烯管=用 1 ml 抽提緩沖液沖洗研杵和研缽，然后移至聚丙烯管中。 3)23000 g，4℃, 離心 20mim 4) 用烤過(guò)的玻璃吸量管將 hS 懸浮液移入 l0 ml 聚丙烯管。 5) 加 0.4 ml2mol/L 乙酸鈉，混勻。加 4 ml 苯酚，混勻。加 0.8 ml 氯仿：異戊醇，混勻。 6) 聚丙烯管置于冰上 15 min 7) 離心，方法如步驟 3) 8) 用烤過(guò)的玻璃吸量管將上層懸浮液移入 30 ml 聚丙烯管，加入同樣容積的 2mol/L乙酸鉀，混勻。 9) 聚丙烯管置于冰上至少 30 min 10)44000 g，4℃ 離心 20 min。 11) 將上清液移入 15 ml 聚內(nèi)烯管，加 0.6～1 倍體積的 100% 的預(yù)冷異丙醇，混勻，-20℃ 放置 45 min 12) 以 27OOOg，于 4℃ 離心 20 min 13) 輕輕倒出上清液，用 Iml70¾乙醇洗滌沉淀，如步驟 12 離心 3mim 盡可能將乙醇倒凈。 14) 加人 400ulDEPC 水溶解沉淀，移至 1.5 ml 管中。 15) 加 100ul10mol/LLiCl, 放置至少 2 h。 16)12000 g，離心 20 min 17) 用 1 ml70% 乙醇洗滌沉淀兩次 18) 加入 200ulTNE 重懸沉淀，再加 500ul100% 乙醇，-20°C 放置至少 15 min。 19) 如步驟 16 離心 5mim。 20) 用 lml70% 乙醇洗滌沉淀兩次。 21) 加入 200～400ulTE 重懸沉淀。 22) 將每個(gè)樣本稀釋 30～50 倍，在 230mn、260mn、280nm 測(cè)量光吸收值。 注意事項(xiàng) 1) 最初的離心除去了大部分不溶性多聚糖，如淀粉顆粒。殘余的組織在管的底部形成暗綠色沉淀 (若用的是葉子），不溶性多糖在殘余組織上面形成灰白色膠狀層 2) 當(dāng)吸取上清液時(shí)，應(yīng)十分小心，勿攪亂膠狀沉淀，因?yàn)樵搶臃浅＼洝Ｉ锨逡旱捏w積大約 4 ml，若因沉淀多面使液體體積明顯不足時(shí)，用柚提緩沖液補(bǔ)足 3) 加人乙酸鉀后，延長(zhǎng)孵育時(shí)間（達(dá) 30 min) 會(huì)提高 RNA 的質(zhì)景，尤其在出現(xiàn)蛋白污染時(shí)。多糖會(huì)形成灰白色膠狀沉淀。若所用的組織多糖含量髙. 延 K 孵育時(shí)間（至 60 min) 也有助于沉淀更多的多糖 4) 加人異丙醇后，不應(yīng)看到沉淀，任何可見(jiàn)的沉淀是表明大量多糖的存在. 孵育時(shí)間大于 60 min，就會(huì)形成多糖沉淀 5)RNA 沉淀應(yīng)為白色，若有灰白色膠狀沉淀則為多糖污染。遇到該情況，將沉淀再懸浮于 200ul TE, 加 1 倍體積的 2mol/L 乙酸鉀，冰上孵育 30 min。12000 g，4°C 離心 20 min. 將上清液移至一新 1.5 ml 管中，用 2.5 倍體積的 100% 乙醇沉淀RNA,-20℃15 min。繼續(xù)方法中的步驟 16) 6) 判斷 RNA 分離的成功與否，可通過(guò)測(cè)量在 230nm、260nm、280mn 處的紫外吸收來(lái)評(píng)估 RNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量。若 A260/230 值小于 2, 則表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A260/280 比值小于 1.7, 表明蛋白污染，在瓊脂 糖凝膠匕出現(xiàn)的 28S 和 18S rRNA，可用以評(píng) 估 RNA 的完整性 7) 該法提取的 RNA 適于 poly(A)+ 的分離，Northern 印跡分析，cDNA 分析，RT-pcr 擴(kuò)增。 |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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2樓2017-01-25 17:05:45
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