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[求助]
去磷酸化 已有2人參與
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| 請問體外表達(dá)的蛋白質(zhì)去磷酸化怎么做?實(shí)驗(yàn)室有CIP(小牛長堿性磷酸酶),可以用這個(gè)嗎?時(shí)間、溫度、反應(yīng)體系如何? |
鐵桿木蟲 (正式寫手)
專家顧問 (職業(yè)作家)
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專家經(jīng)驗(yàn): +702 |
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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可以用CIP,反應(yīng)溫度是37攝氏度,我一般處理時(shí)間是2小時(shí)左右,然后中間一直旋轉(zhuǎn)孵育。注意,加蛋白酶抑制劑會比較好。 我用的buffer終濃度是100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, pH 7.9。 樣品最好是IP下來或者純化后的,體系用50微升應(yīng)該沒問題。 你可以再查一下這篇文獻(xiàn)參考一下:Kornhauser, J. M., Cowan, C. W., Shaywitz, A. J., Dolmetsch, R. E., Griffith, E. C., Hu, L. S., Haddad, C., Xia, Z., and Greenberg, M. E. (2002) CREB transcriptional activity in neurons is regulated by multiple, calcium-specific phosphorylation events. Neuron 34, 221-233 |
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