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清嗓金聲
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[交流]
PCR技術(shù)及退火溫度優(yōu)化問題 已有6人參與
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最近在擴(kuò)一個(gè)家族的相關(guān)基因（植物），擴(kuò)不出來(lái)的基因采用在基因內(nèi)部設(shè)計(jì)2個(gè)引物分別和兩端的引物配對(duì)分開擴(kuò)，得到2個(gè)片段后，怎樣拼接得到全長(zhǎng)？ 有的基因是兩個(gè)片段擴(kuò)不出來(lái)，可能是表達(dá)豐度低。擴(kuò)增時(shí)退火溫度怎么優(yōu)化？我看到一般是Tm值-5度，或者兩個(gè)引物Tm值平均值-5度。采用先60度5cycles再55度30cycles、先55度5cycles再60度32cycles，和單純55度38cycles、單純60度38cycles的區(qū)別在哪里，如果采用這四個(gè)其中一種程序去擴(kuò)增擴(kuò)不出來(lái)目的條帶，是不是其余三種一般也擴(kuò)不出來(lái)?在Tm相近的一對(duì)引物61℃/62℃在55度有非特異條帶，但無(wú)目的條帶，在66度6cycles/60度32cycles擴(kuò)增則無(wú)條帶.該怎優(yōu)化? 實(shí)驗(yàn)新手，感覺知識(shí)面較窄，有些問題差不多想要的，特來(lái)此站求助。擴(kuò)增基因較多，還得趕進(jìn)度。感謝大家回答�。。�  |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-03 22:34:08
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-03 22:34:08
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第一個(gè)問題，兩個(gè)前段的拼接需要做重疊pcr. 一般退火溫度是引物的Tm值-5,如果出現(xiàn)非特性性擴(kuò)增且有目的條帶，就做切膠回收或者提高退貨溫度進(jìn)而提高特異性。你提到的先做幾個(gè)循環(huán)再做30個(gè)循環(huán)我在重疊pcr中見過(guò)，目的是先p出整個(gè)模板，再進(jìn)行整個(gè)片段的pcr.對(duì)重疊有利。 有非特異性條帶無(wú)目的條帶，首先非特異性條帶可能是引物二聚體，無(wú)目的條帶可能是模板加入太多，導(dǎo)致自身退火（看到小木蟲有人說(shuō)過(guò)，我不太確定）可以降低退火溫度減少模板量，看是否有目的條帶出現(xiàn)， 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-11-22 13:35:01
star013 
新蟲 (知名作家)
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3樓2016-11-22 14:31:34
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8樓2016-12-09 10:05:47
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