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xmczhby新蟲 (小有名氣)
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[交流]
肝臟細(xì)胞RNA的提取 已有3人參與
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一．原理 RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組 學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ)。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機(jī)制，已成為分子生物學(xué)研究的一個(gè)重要手段。對(duì)某一生物或組織進(jìn)行性狀研究，首先要獲得該性狀基因，從組織細(xì)胞中分離完整的RNA對(duì)于分子克隆 和基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)是至關(guān)重要的，如Northern印跡及雜交分析、cDNA合成等實(shí)驗(yàn)的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。利用提取的RNA人們可以對(duì)特定的基因表達(dá)進(jìn)行定量的檢測(cè)，從分子水平精確的了解細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律。通常一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含有10-5μgRNA ，其中80%～85%為rRNA（主要是28S、18 S和5.8 S、5S四種類型）；10%～15%為tRNA和核內(nèi)小分子RNA。 這些高峰度的RNA的大小和序列確定，可通過(guò)凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離。相反，占RNA總量1%～5%的為mRNA 。mRNA 雖然大小和核苷酸序列各不相同，從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)組成的尾，其長(zhǎng)度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸―纖維素[oligo(dT)] ，使得mRNA可以利用親和層析法分離。這個(gè)群體編碼了所有由該細(xì)胞合成的多肽。研究表明RNA極不穩(wěn)定，易于降解，而RNA酶幾乎無(wú)處不在，且特別穩(wěn)定，故在提取RNA時(shí)關(guān)鍵因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力，因此，創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，嚴(yán)格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。 對(duì)內(nèi)源性RNA酶，主要運(yùn)用RNA酶抑制劑，目前常用的RNA酶抑制劑有： ①RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑(RNasin)，它是從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì)，可以與多種RNA酶緊密結(jié)合形成非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑制品經(jīng)數(shù)次凍融后或放在氧化條件下應(yīng)棄之不用。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中的翻譯； ②氧釩核糖核苷復(fù)合物，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物，是一種過(guò)渡態(tài)似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并高效抑制RNA酶活性。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以除之； ③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后續(xù)的RNA純化過(guò)程中經(jīng)離心除去； ④異硫氰酸胍，它是強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，在破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從細(xì)胞核中解離出來(lái)的同時(shí)也使RNA酶變性失活； ⑤焦碳酸二乙酯(DEPC)，它是RNA酶強(qiáng)烈抑制劑，但其作用并不是絕對(duì)的。DEPC主要用于不能高壓滅菌的材料和器皿的RNA酶處理； ⑥其它化學(xué)試劑，如SDS、尿素等對(duì)RNA 酶也有一定的抑制作用。 對(duì)外源性RNA酶主要通過(guò)以下幾個(gè)途徑污染RNA制品： ①玻璃制品、塑料制品和電泳槽； ②研究人員造成的污染； ③污染的溶液。 因此在實(shí)驗(yàn)中必須采取下列措施抑制外源性RNA酶： ①實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃制品和塑料制品經(jīng)常有RNA酶污染，使用前必須于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿沖洗(塑料制品)。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌，水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1%DEPC水徹底沖洗電泳槽。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無(wú)RNA酶，可以不需要處理； ②在RNA提取過(guò)程中,應(yīng)戴一次性手套,對(duì)接觸可能污染的器皿時(shí)，應(yīng)勤換手套； ③配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對(duì)不能高壓滅菌的試劑，用經(jīng)DEPC水配制處理過(guò)的無(wú)菌蒸餾水配制，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。 真核細(xì)胞總RNA 制備方法有多種，包括異硫氰酸胍—氯化銫超速離心法、鹽酸胍—有機(jī)溶劑法、氯化鋰—尿素法以及熱酚法、異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol試劑提取法等。目前實(shí)驗(yàn)室提取總RNA的常用方法為異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol試劑提取法。異硫氰酸胍法制備真核細(xì)胞總RNA，是將已知最強(qiáng)的RNase酶抑制劑異硫氰酸胍、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解，增強(qiáng)了核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA和蛋白質(zhì)分離并進(jìn)入溶液，RNA選擇性地進(jìn)入無(wú)DNA和蛋白質(zhì)的水相，容易被異丙醇沉淀濃縮。 二． 材料與方法 1 材料 實(shí)驗(yàn)魚，購(gòu)于市場(chǎng)。 2 儀器、用具 臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋（70℃）、分析天平、移液器、一次性注射器、方盤、鑷子、手術(shù)剪、培養(yǎng)皿、1.5ml離心管。 3試劑 95%的RNase-free乙醇；0.1%DEPC處理水；SV RNA Lysis Buffer；SV RNA dilution Buffer；SV RNA Wash Solution；Yellow core Buffer；MnCl2 ；0.09M；DNase Ⅰ；SV DNase Stop Solution；Nuclease-Free water。 4 方法 1） 材料的準(zhǔn)備 (1) 將培養(yǎng)皿、剪刀、眼科鑷滅菌，-20℃預(yù)冷。 (2) 用泡沫盒盛裝碎冰，將培養(yǎng)皿置于冰上，將剪刀、鑷子置于培養(yǎng)皿中。 (3) 用桶盛裝碎冰，加入少量的自來(lái)水，用紗布包裹魚放入桶中。 (4) 將已麻痹的魚置于方盤中，用剪于肛門向前及斜向上將腹腔剪開，取出內(nèi)臟，分離肝臟置于培養(yǎng)皿中。 (5) 取1.5ml的離心管于分析天平上，調(diào)零。 (6) 用鑷子取20-30mg的肝臟組織于1.5ml的離心管中，稱重。 2） 實(shí)驗(yàn)操作 (1) 取約30mg組織于1.5ml 離心管中，加入175μl SV RNA Lysis Buffer，用一次性注射器將組織壓碎、反復(fù)抽打混勻。 (2) 加350μl SV RNA Dilution Buffer（藍(lán)色），翻轉(zhuǎn)管子3-4 次混勻，置70℃水浴3min。 (3) 冰上冷卻1-2秒，14000rpm離心10min，上清液移入一新離心管。 (4) 加入200μl 95%的乙醇，槍頭混勻。 (5) 將上述混合液移入Spin Basket Assembly，14000rpm離心1min，棄濾液。 (6) 加入600μl SV RNA Wash Solution（with ethand added），14000rpm離心1min，棄濾液。 (7) 在一新離心管中配制DNase incubation mix： Yellow Core Buffer 40μl MnCl2 0.09M 5μl DNase Ⅰ 5μl (8) 將上述50μl混合液直接加在Spin Basket的膜上，室溫（20-25℃）保育15min。 (9) 加200μl SV DNase Stop Solution（with ethand added）至Spin Basket 14000rpm，離心1min。 (10) 加600μl SV RNA Wash Solution，14000rpm離心1min，棄濾液。 Yellow core Buffer 40μl MnCl2，0.09M 5μl DNase I 5μl (11) 加250μl SV RNA Wash Solution，14000rpm離心2min，將Spin Basket轉(zhuǎn)移到一新離心管中。 (12) 加50μl Nuclease-Free Water 至膜上，14000rpm離心1min，溶解RNA，-20℃保存。 (13) 取5μl RNA樣品，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。 |
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