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蛋白質(zhì)連接技術(shù)
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含羥基的小分子蛋白的交聯(lián) 這一類小分子包括糖、核苷酸、酚和醇，一般不能直接用于與蛋白的結(jié)合。將醇轉(zhuǎn)變成琥珀酸半酯(半琥珀酸鹽)則衍生了一個可用于結(jié)合的羧基，這種方法已用于許多小分子與蛋白的耦聯(lián)。此外，雙功能試劑葵二酰二氯(sebacoyldichloride)可將醇轉(zhuǎn)變成氯酸，氯酸在pH8．5時，很容易與蛋白發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)。 1．醇羥基通過半琥珀酸鹽的形成而轉(zhuǎn)變成羧基 目的：使含羥基的醇易于與蛋白耦聯(lián)。 操作步驟： (1)將15g 2，2，2—三氯乙醇(trichloroethan01)、12g琥珀酸酐(succinic anhydride)和8．7ml三乙胺(triethylamine)溶于100 ml乙酸乙酯； (2)加熱及回流1h； (3)蒸發(fā)溶劑，用5％Na2C03水溶液溶解殘渣； (4)用乙醚洗2次，然后再用H：S04調(diào)pH至2．0； (5)用水洗最后的固體(2，2，2—三氯乙酰半琥珀酸鹽)2次，然后從氯仿—己烷中重結(jié)晶(產(chǎn)率約為75％，熔點88～900C)： (6)加2．5g半琥珀酸鹽至6．5 ml亞硫酰氯(thionylchloride)中，65~C加熱30min； (7)真空蒸發(fā)至干，置殘渣于高真空下1 h； (8)用15 m1N，N—二甲基乙酰胺溶解固體(2，2，2—三氯乙酰琥珀酰氯)，與2．79g小分子的羥基，即1—p—D-arabinofuranofuranosylcytosine的5，—OH反應(yīng)，室溫攪拌2 h； (9)65~C毒真空下蒸發(fā)，再從異丙醇中重結(jié)晶(產(chǎn)率：約84％的結(jié)晶5，酯以鹽酸鹽形式存在，熔點1600C)； (10)為得到小分子—半琥珀酸鹽，用溶于DMF的鋅和醋酸裂解三氯乙酯，因此，衍生的羧基可使用諸如碳二亞胺的方法結(jié)合于蛋白上。 酚則可用重氮化的對氨基苯酸活化，于是對氨基苯酸可引入一個羧基，然后再通過混合酸酐的反應(yīng)耦聯(lián)載體蛋白或酶分子。 糖可通過Landsteiner方法活化，形成一種對硝基苯葡萄糖苷，接著硝基還原，重氮化后形成結(jié)合。還有一個簡單的方法是將糖的鄰近乙二醇氧化裂解成醛基，醛基然后通過還原性烷基取代而結(jié)合至氨基上。這種方法已成功地用于核苷、核苷酸和地高辛與蛋白的耦聯(lián)。 2．使用NaIO4‘氧化糖類小分子鄰近乙二醇而耦聯(lián)腺苷與—半乳糖苷酶 目的：使糖類小分子能與蛋白耦聯(lián)。 操作步驟： (1)溶解20 mg腺苷(adenosine)于1 m1 100 mmol／LNal04溶液中，4~C暗處反應(yīng)30rain； (2)加1滴乙二醇； (3)將氧化好的腺苷加至p—半乳糖苷酶溶液(20 mg／m1 150mmol／L NaCl和10 mmo!／L MgCl2，用K2C03調(diào)pH至9．0)中； (4)40C反應(yīng)2 h，保持pH 9．0； (5)加入1／10體積的新鮮制備的NaBH，(50mg／m1)，40C反應(yīng)過夜； (6)用含10mmol／LMgCl2，10mmoi／L 2—ME和10mmo!／LNaCi的50mmol／LPB(pH7．4)緩沖液透析。 |
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