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大鼠肝星狀細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 已有4人參與
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大鼠肝星狀細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：（1）用于細(xì)胞保種；（2）用于分子生物學(xué)研究；（3）用于基因治療研究。 實(shí)驗(yàn)方法原理 將小鼠的肝細(xì)胞從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠 試劑、試劑盒：戊巴比妥鈉、小牛血清、DMEM、酶消化液、D-Hanks' 液、酚紅、臺(tái)盼蘭、HBSS、氯化鈉、PBS 儀器、耗材：手術(shù)刀、手術(shù)剪、尼龍網(wǎng)、相差顯微鏡、熒光顯微鏡 一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1. 動(dòng)物：雄性SD大鼠(體重250-450 g)。 2. 試劑：戊巴比妥鈉，小牛血清(或胎牛血清，則更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L)，HBSS，臺(tái)盼蘭等。 3. 器械：手術(shù)器械，200目尼龍網(wǎng)，相差顯微鏡，熒光顯微鏡。 二、原代培養(yǎng)方法 1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹，進(jìn)行門靜脈插管，以D-Hanks'液灌注，同時(shí)剪開下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。 2. 待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min，尼龍網(wǎng)過濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。 3. 以HBSS重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g離心16 min后取界面細(xì)胞。 4. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并判斷存活率和產(chǎn)量，最后按照常規(guī)方法接種(105細(xì)胞/cm2)，次日換液，以后每2-3天換液一次。 三、傳代方法 棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA，可以不需離心)，充分吹打后以1:2-1:3接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2，37℃)。 四、 結(jié)果 接種次日，光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328 nm處見自發(fā)熒光。 五、注意事項(xiàng) 1. 進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和α-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。 2. 采用無須原位消化的方案，完全可行，只不過消化時(shí)間更難控制！實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(最好5代以內(nèi))。 |
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