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分子診斷實(shí)驗(yàn)方法
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生物大分子主要指核酸(DNA和RNA)和蛋白質(zhì)，通過(guò)從分子水平上完成DNA, RNA或蛋白質(zhì)檢測(cè)，從而對(duì)疾病作出診斷的方法稱為分子診斷，目前常用的方法有基因診斷和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)兩種。 基因診斷 基因診斷是用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，通過(guò)直接探查基因的存在狀態(tài)或缺陷，從基因結(jié)構(gòu)、定位、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯水平分析基因的功能，從而對(duì)人體狀態(tài)與疾病做出診斷的方法。 人體基因組的類型早在受精卵開(kāi)始時(shí)就已形成，因此在人體發(fā)育的任何時(shí)期，只要獲得受檢者的基因組DNA，應(yīng)用恰當(dāng)?shù)腄NA分析技術(shù)，便能鑒定出缺陷的基因，而不論該基因產(chǎn)物是否已經(jīng)表達(dá)。而且，應(yīng)用這一方法，不僅能夠檢測(cè)單個(gè)堿基置換、缺失和插入等，還能發(fā)現(xiàn)DNA的多態(tài)現(xiàn)象以及遺傳病的異質(zhì)性�；蛟\斷檢測(cè)的目標(biāo)分子是DNA或RNA，反映基因的結(jié)構(gòu)和功能。檢測(cè)的基因有內(nèi)源性(即機(jī)體自身的基因)和外源性(如病毒、細(xì)菌等)兩種，前者用于診斷基因有無(wú)病變，后者用于診斷有無(wú)病原體感染。 基因診斷的意義在于不僅能對(duì)某些疾病做出確切診斷，如確定某些遺傳病，也能確定基因與疾病有關(guān)聯(lián)的狀態(tài)，如對(duì)疾病的易感性、發(fā)病類型和階段的確定等。就目前已經(jīng)開(kāi)展的工作而言，外科領(lǐng)域的遺傳性疾病、遺傳易感性疾病、多種惡性腫瘤、感染性疾病、器官移植反應(yīng)等都可以用基因診斷的方法加以診斷。 基因診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)和生物芯片技術(shù)。 1．核酸分子雜交技術(shù) 1）原理： 具有一定互補(bǔ)序列和核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列和探針序列。應(yīng)用該技術(shù)可對(duì)特定DNA或RNA序列進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。 2）基因探針及其標(biāo)記： 基因探針是一段與待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，可以是DNA或RNA，長(zhǎng)度不一，可為完整基因，也可為其中一部分。根據(jù)探針的來(lái)源和性質(zhì)分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針。作為探針至少必須滿足兩個(gè)條件，一是應(yīng)為單鏈(或通過(guò)變性形成單鏈)，二是應(yīng)帶有可被示蹤和檢測(cè)的標(biāo)記。有了合適的探針，就有可能檢測(cè)出目的基因，觀察有無(wú)突變，也可根據(jù)探針的結(jié)合量進(jìn)行定量檢測(cè)。在與DNA樣本雜交過(guò)程中，借助上述標(biāo)記物可探察出特異性或差異性DNA。雙鏈DNA的變性和復(fù)性特點(diǎn)是本技術(shù)的基礎(chǔ)。經(jīng)加熱，或在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿作用下，雙鏈DNA氫鍵被破壞，雙股鏈分離，變成單鏈（此即變性）；而當(dāng)條件緩慢變?yōu)橹行曰驕囟认陆担?0oC左右）時(shí)，氫鍵恢復(fù)，分開(kāi)的兩股單鏈又重新合為互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)（此即復(fù)性）。DNA探針?lè)肿与s交就是將樣本DNA分子經(jīng)上述條件處理后，使其變性為單鏈狀態(tài)，固定在載體硝酸纖維膜上，再與經(jīng)小分子標(biāo)記的DNA探針單鏈分子混合，在一定條件下使它們互補(bǔ)雜交結(jié)合。將未雜交的成分洗脫后，標(biāo)記物顯色，即可觀察結(jié)果。選擇探針最基本的原則是要有高度特異性，其次也需考慮到制備探針的難易性和檢測(cè)手段的靈敏性等其他因素。 目前，DNA探針已用于瘧原蟲、隱孢子蟲、賈第蟲、錐蟲、巴貝斯蟲、弓形蟲、絲蟲、血吸蟲、棘球蚴、豬帶絳蟲、肝片吸蟲和豬囊蟲等蟲種的鑒定和相應(yīng)疾病的診斷上。 3）常用核酸分子雜交技術(shù)：①Southern印跡雜交；②Northern印跡雜交；③斑點(diǎn)雜交( dotblotting)；④原位雜交(in situ hybridization)；⑤夾心雜交(三明治雜交)；⑥液相雜交。 2．聚合酶鏈反應(yīng)(即polymerase chain reaction，pcr) PCR是在引物介導(dǎo)下特異性擴(kuò)增DNA的技術(shù)。它包括模板DNA熱變性解鏈—引物與模板DNA退火—引物延伸3個(gè)步驟的循環(huán)過(guò)程。其基本原理是在實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)溫度的變化控制DNA解鏈和退火（引物與模板DNA結(jié)合），在引物啟動(dòng)和DNA聚合酶催化下，合成二引物特定區(qū)域內(nèi)的DNA鏈。上述“解鏈—退火—延伸”3個(gè)連續(xù)步驟為一個(gè)循環(huán)。經(jīng)過(guò)20 ～ 30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，可使引物特定區(qū)段的DNA量增加至少105倍。 1）原理： PCR是模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，擴(kuò)增出所需目的DNA。包括三個(gè)基本步驟：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈(變性)；在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)(退火)；在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸。 2）PCR引物： PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性，引物設(shè)計(jì)決定PCR反應(yīng)的成敗。由于致病基因是在正�；蛐蛄兄邪l(fā)生點(diǎn)突變、片段插人和(或)缺失，基因兩翼的DNA序列和正常基因仍然相同，因此根據(jù)基因兩翼的DNA序列可設(shè)計(jì)出各20個(gè)堿基左右的一對(duì)引物。 3）常用PCR技術(shù)： 利用PCR技術(shù)，在適當(dāng)條件下擴(kuò)增目的基因，然后分析PCR產(chǎn)物，便可判斷其是否為致病基因及其變異性質(zhì)。此外，PCR具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速、樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。反應(yīng)過(guò)程可在PCR儀內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行，根據(jù)需要目前已衍行和發(fā)展出以下方法：①常規(guī)PCR；②復(fù)合PCR；③反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)；④原位PCR；⑤反向PCR；⑥膜結(jié)合PCR；⑦彩色PCR；⑧定量PCR；⑨固著PCR；⑩免疫PCR。 目前，PCR技術(shù)多用于寄生蟲病的基因診斷，分子流行病學(xué)研究和種株鑒定、分析等領(lǐng)域。已應(yīng)用的蟲種包括利什曼原蟲、瘧原蟲、弓形蟲、卡氏肺孢子蟲、阿米巴、巴貝氏蟲、旋毛蟲、錐蟲、隱孢子蟲、賈第蟲、豬帶絳蟲和絲蟲等。 3．生物芯片技術(shù) 生物芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)與微電子技術(shù)相結(jié)合的核酸分析檢測(cè)技術(shù)。最初的生物芯片技術(shù)主要目標(biāo)是用于DNA序列測(cè)定、基因表達(dá)譜鑒定和基因突變體檢測(cè)和分析，所以又稱為DNA芯片或基因芯片技術(shù)。由于目前這一技術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯片、免疫芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等，所以改稱生物芯片技術(shù)更符合發(fā)展趨勢(shì)。 |
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