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wy604987664新蟲 (小有名氣)
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[交流]
雙酶切連接轉(zhuǎn)化平板長很多，但都是假陽性
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最近1個月做實驗，每次構(gòu)建表達載體平板上都是長很多單克隆，但送測后不是載體自連就是無信號。是載體沒有完全切開？還是抗生素的問題？還是連接？ 用賽默飛的快切酶，一般切40分鐘左右。用的酶切位點也是平時常用的。以前用同樣的酶切20分鐘都沒什么問題 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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我也在做這個，酶切的話載體最好過夜，盡可能的酶切完全。還有轉(zhuǎn)化的時候可以做個對照 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-12-09 23:14:35
mochenmi
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就是再仔細看看酶切位點是不是設(shè)計的合適，可能載體上還有另一個你用的酶切位點。 另外在pcr，提質(zhì)粒甚至照紫外的時候都有可能發(fā)生突變，有一定概率形成一個酶切位點，這樣載體就被切壞了。 如果老是做不出，建議重新提質(zhì)粒再酶切，回收。不要一直用之前的回收產(chǎn)物做連接。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
10樓2016-12-10 12:04:24
mochenmi
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2016-12-10 09:02:19
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仔細再分析下酶切位點和切完后的片段大小，看是不是把載體切壞了。連接轉(zhuǎn)化一般不會出問題的，剛做實驗的新手也能成功。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-12-09 23:50:07
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6樓2016-12-10 04:21:48
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7樓2016-12-10 04:22:53
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