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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 綜合其他 » 甲基化檢測方法
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甲基化檢測方法 已有2人參與
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甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠對大家有所幫助。 第一部分 基因組DNA的提取 這一步沒有懸念，完全可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取完全可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。 此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。 使用兩者的細節(jié)： 1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。 驗證提取DNA的純度的方法有二： 1、紫外分光光度計計算OD比值； 2、1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。 我傾向于第二種方法，這種方法完全可以明確所提基因組DNA的純度，并根據Marker的上樣量估計其濃度，以用于下一步的修飾。 第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經高壓蒸汽滅菌。 1、將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul； 2、加5.5ul新鮮配制的3M NaOH； 3、 42℃水浴30min； 水浴期間配制： 4、10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色） 5、 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6、EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。 7、加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。 8、50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm開始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，時間上很合適。 這一步細節(jié)： 1、基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾最多可至4ug。 2、所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術要過關，既要快，又要精確。 3、亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用堿將PH調制5.0，否則PH不合適會影響后續(xù)純化吸收。 4、水浴最好達16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不完全。 |
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2樓2017-01-25 16:26:42
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3樓2017-02-04 10:13:37
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