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雙向電泳完整的操作步驟 已有2人參與
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（一）第一向等電聚焦 1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。 2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。 3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。 4. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。 5. 沿著聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中槽的邊緣至左而右線(xiàn)性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。 6. 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。 7. 分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤(pán)的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。 8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。 9. 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。 10.聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤(pán)中，-20℃冰箱保存。 （二）第二向SDS-PAGE電泳 1. 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。 2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。 3. 從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。 4. 配制膠條平衡緩沖液I。 5．在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。 6. 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤(pán)中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤(pán)放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。 7. 配制膠條平衡緩沖液II。 8. 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤(pán)中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。 9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂慷宰拋約骸? 10.將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。 11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。 12.第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤(pán)中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。 13.將IPG膠條從樣品水化盤(pán)中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。 14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。 15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。 16.放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。 17.在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。 18.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線(xiàn)后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。 19.電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。 20.進(jìn)行染色。 |
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