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專業(yè)蛋白質(zhì)westernblot檢測的詳細(xì)方法 已有1人參與
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WESTERN BLOT ①將蛋白電泳后的凝膠浸入電轉(zhuǎn)緩沖液中15min。 ②將電轉(zhuǎn)膜（醋酸纖維素膜）先在甲醇中浸泡至完全濕潤（甲醇用于活化電轉(zhuǎn)膜上的基團(tuán)，可能是使得膜上的正電性增強(qiáng)），然后再將膜浸入超純水中5min，最后再將膜浸入電轉(zhuǎn)液中15min。 ③濾紙先在電轉(zhuǎn)液中完全浸濕，然后將濾紙平鋪在電轉(zhuǎn)纖維上，在濾紙正上方平鋪凝膠，在凝膠正上方平鋪電轉(zhuǎn)膜，在電轉(zhuǎn)膜正上方平鋪濾紙，最后用玻棒趕氣泡。（注：濾紙一定要比電轉(zhuǎn)膜略小，也可比凝膠略小，最好與凝膠大小一致；電轉(zhuǎn)膜應(yīng)與凝膠大小一致或略大；理論上，電轉(zhuǎn)膜的大小只要能夠覆蓋住目標(biāo)區(qū)域即可）。 ④100V，電轉(zhuǎn)100min。（注：電轉(zhuǎn)儀置于冰浴中，并且電轉(zhuǎn)儀中還要放入攪拌子；注意電轉(zhuǎn)時(shí)的正負(fù)極，黑色朝向黑色）。 ⑤電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡于甲醇中5min，最后將電轉(zhuǎn)膜浸泡于4ml 10%的牛奶（2g奶粉溶于20ml超純水）中（5%BSA），置于37℃搖床（75rpm）封閉1.5h（也可4℃封閉過夜）。 （注1：若采用預(yù)覽的Marker可以在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后看到Marker條帶是否轉(zhuǎn)移到膜上，據(jù)此判斷蛋白條帶是否轉(zhuǎn)移到膜上，因此可省略麗春紅浸泡觀察等過程，直接封閉。 注2：不論是封閉還是后面的加一抗和二抗，都要將自封袋中的氣泡趕走，尤其是大氣泡，因?yàn)榇髿馀莸拇嬖谧韪袅伺Ｄ�、一抗和二抗與膜的接觸，不利一抗與二抗的接觸，導(dǎo)致后面顯色不明顯；搖床轉(zhuǎn)速不能太快，否則會(huì)一抗與二抗即使結(jié)合了又會(huì)被甩分開）。 ⑥封閉1.5h結(jié)束后，電轉(zhuǎn)膜用PBST溶液（1L 1×PBS溶液+500ulTween-20，注意Tween粘度較大，吸取時(shí)要慢，否則吸不夠量；同樣地，打出時(shí)也要慢，否則會(huì)沒有全部打出）洗3次，每次10min。 ⑦將電轉(zhuǎn)膜浸入一抗溶液中，置于37℃搖床，75rpm，1.5h（一抗溶液的制備：10ml的10%脫脂牛奶或BSA溶于PBST中+5-10ul一抗，即共稀釋了1000-2000倍，可根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)抗體稀釋倍數(shù)）。 ⑧一抗溶液浸泡結(jié)束后，將電轉(zhuǎn)膜用PBST溶液洗3次，每次10min。 ⑨將電轉(zhuǎn)膜浸入二抗溶液中，置于37℃搖床，75rpm，1h（二抗溶液的制備同一抗）。 ⑩二抗溶液浸泡結(jié)束后，將電轉(zhuǎn)膜用PBST溶液洗3次，每次10min。洗完后，將膜浸泡于底物溶液中顯色，顯色結(jié)束后，用濾紙吸干膜上的水分，將膜置于凝膠成像儀中用白光拍照。電轉(zhuǎn)膜用保鮮膜包裹保存（有時(shí)顯色時(shí)間過長，導(dǎo)致背景顏色較深，則拍照時(shí)可將電轉(zhuǎn)膜反過來拍背面）。 注：凝膠和電轉(zhuǎn)膜都要用剪刀剪去一角用以定位。 |
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雨小桐
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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請(qǐng)問一抗溶液配制時(shí)，用的蒸餾水會(huì)怎樣呢？overnight了之后，用重新配置的正確的一抗再做還來得及么？謝謝 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2017-03-23 14:49:10
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