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ljf0814銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
絕對定量PCR具體步驟求助！ 已有2人參與
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| 本人定量新手�，F(xiàn)在已經(jīng)用帶有目的序列的質(zhì)粒做好了標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)備測處理過的樣品里的相應(yīng)基因的表達(dá)量。請問我提取總RNA之后該用多少RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄好后該怎么處理cDNA，該定量體系里該加多少cDNA做模板？我做標(biāo)準(zhǔn)曲線時用的是20ul體系。懇請大家?guī)兔�，越詳�?xì)越好，謝謝啦！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 一般情況RNA質(zhì)量提取還不錯的話，10μL反轉(zhuǎn)體系可以加1000ng的RNA，20μL反轉(zhuǎn)體系可以加2000ng的RNA。20μL的上機實驗加1μL的cDNA就足夠了。具體的反轉(zhuǎn)錄母液，如果RNA質(zhì)量沒有問題稀釋個4到5倍做基因表達(dá)都還是效果不錯的。你可以根據(jù)你所做基因的多少選擇稀釋倍數(shù)以及反轉(zhuǎn)錄體系。比如說你做4個基因，你可以選擇10μL體系反轉(zhuǎn)錄，加入20μL的水，相當(dāng)于稀釋了3倍這樣的模板也是夠用的。 |
2樓2017-01-03 10:02:13
star013 
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3樓2017-01-03 10:09:39
ljf0814
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4樓2017-01-03 20:03:45
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5樓2019-12-16 17:03:24
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