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z妲妲專家顧問
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幾種基本蛋白質(zhì)濃度測定方法比較（三）-評(píng)價(jià) 已有3人參與
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1.紫外法: 紫外分光光度法是以紫外光為光源、波段在180～360nm的分光光度法。基本原理及儀器構(gòu)造與分光光度法類同。主要用于有機(jī)化合物鑒定及結(jié)構(gòu)分析，對(duì)具有π鍵電子及共軛雙鍵化合物特別靈敏，還可對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒別。無機(jī)分析多用于定量測定。 可以利用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在275--280nm具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。 最常用的紫外吸收法是280 nm的光吸收法，含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用280nm和260nm的吸收差較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用215nm與225nm的吸收差法。 紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因?yàn)榇藭r(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。 缺點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)較多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差，故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收，但通過校正可以消除。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。 此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時(shí)的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。 2. 雙縮脲法： 雙縮脲(NH3C0NHC0NH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能夠以1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。所有的蛋白質(zhì)均有此顯色反應(yīng)。雙縮脲試劑就是指能與具有兩個(gè)以上肽鍵的化合物發(fā)生紅紫色顯色反應(yīng)的試劑.它是NaOH和CuSO4兩種溶液.在實(shí)驗(yàn)過程中,先在含蛋白質(zhì)的溶液中加入等體積的NaOH溶液,混合均勻后,再滴幾滴CuSO4溶液(量較少).即先后加入NaOH和CuSO4溶液.如果在NaOH中滴幾滴CuSO4溶液混合后,再加入到含蛋白質(zhì)的溶液中,混合液中就沒有Cu2+,顯色反應(yīng)就不會(huì)發(fā)生.紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。 雙縮脲法中樣品的取用量對(duì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響，采用0．5 g樣品，40 mL雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮脲法對(duì)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，不受溫度的影響�？煽焖贉y定蛋白質(zhì)含量，試劑單一，方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為l～2O mg蛋白質(zhì)。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測定。 除-CONH-有此反應(yīng)外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基團(tuán)亦有雙縮脲反應(yīng)，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。 3. 福林酚法： 顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin―酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。 Folin―酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。 酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉―氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉―氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。 使用該方法測定時(shí)要注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用與測定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度。 進(jìn)行測定時(shí)，加Folin―酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅―蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸―磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。 此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。 此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20~250mg。 4：考馬斯亮藍(lán)法： 考馬斯亮藍(lán)法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的�？捡R斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收波長從465 nm變?yōu)?95 nm，蛋白質(zhì)在1～1 000 u g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)一色素結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。 考馬斯亮藍(lán)法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高：蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測定的靈敏度較高，最低檢出量為1ug蛋白質(zhì)。據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍。 （2）測定快速、簡便：染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。 此法的缺點(diǎn)是： （1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 γ—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。 （2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH，少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照消除，而必要時(shí)必須預(yù)先處理樣品。 （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度 |
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 分子分子 | 蛋白質(zhì)濃度測定 |
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