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Nigori

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[交流] 表達(dá)譜基因芯片實(shí)驗(yàn) 已有1人參與

實(shí)驗(yàn)方法原理

基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又稱DNA微陣列(DNA Micorarray)，是指按照預(yù)定位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬(wàn)個(gè)核酸分子所組成的微點(diǎn)陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來(lái)自樣品的序列互補(bǔ)的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進(jìn)行標(biāo)記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測(cè)到雜交信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)材料 組織或細(xì)胞樣本

試劑、試劑盒：TRIzol、異丙醇、乙醇、氯仿、dNTPs、雜交試劑盒

儀器、耗材：電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、電子天平、低溫高速離心機(jī)、低溫高速臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、制冰機(jī)、電熱恒溫水槽、電泳槽、電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、臺(tái)式離心機(jī)、核酸定量分析儀、移液槍、可調(diào)電爐、旋渦混合器、雜交箱、雜交艙、Ｓ-200純化柱、真空濃縮儀、蓋玻片、芯片掃描儀

實(shí)驗(yàn)步驟

一、總RNA提取

1. 將超低溫保存的樣品除去樣品袋，在電子天平上稱重后，轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的碾缽中，用杵子碾磨組織，其間不斷加入液氮，直至碾磨成粉末狀。

2. 將碾磨成粉末狀的樣品，轉(zhuǎn)移至已經(jīng)加入適量TRIzol試劑的勻漿管中，把勻漿管置于冰浴中，在組織勻漿粉碎機(jī)上進(jìn)行勻漿。勻漿至勻漿液不粘且無(wú)顆粒即可。

3. 將勻漿液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，于4℃，12 000 g，離心10 min。

4. 小心吸取上清液轉(zhuǎn)入新的15 mL離心管，在15~30℃放置5 min。

5. 向勻漿液中加入氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，在15~30℃放置3 min。

6. 于4℃，12 000 g，離心15 min。

7. 從離心機(jī)中小心地取出離心管，吸取上清至另一15 mL離心管。

8. 向上清加入異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，在15~30℃放置10 min。

9. 于4℃，12 000 g，離心10 min。

10. 棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇5 mL，輕輕顛倒洗滌離心管管壁，小心棄去乙醇。

11. 再加入75%乙醇10 mL，在渦旋器上短暫渦旋；于4℃，8 000 g離心10 min。

12. 小心棄上清，短暫離心，用移液槍吸去所有上清，在超凈工作臺(tái)中干燥沉淀5 min。

13. 加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。

二、探針標(biāo)記與雜交

1. 預(yù)雜交

（1）配制預(yù)雜交液：雜交試劑1加入到的Eppenderf管中，振蕩混勻后，加入雜交試劑2混勻。

（2）將配制好的預(yù)雜交液放入95℃水浴鍋內(nèi)變性2 min，將待預(yù)雜交的玻片放入95℃水浴鍋內(nèi)變性30 s，玻片取出后即放入無(wú)水乙醇中30 s，晾干。

（3）將已變性的預(yù)雜交液加到玻片的點(diǎn)樣區(qū)域內(nèi)，蓋上蓋玻片，放入雜交箱內(nèi)42℃預(yù)雜交5～6 h。

2. 標(biāo)記探針（以下在冰浴中進(jìn)行）

（1）于一已滅菌的1.5 mL Eppendorf管內(nèi)依次加入以下試劑(反應(yīng)終體積為50 μL，以下試劑均為RNase－free)：

ddH2O 23 μL

逆轉(zhuǎn)錄引物 5 μL

總RNA 50~100 μg

振蕩混勻，置于70℃水浴10 min。取出后，迅速置于冰上。

（2）分別加入以下試劑：

逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 10 μL

DTT 5 μL

dNTPs 4 μL

（3）而后在暗室中加入以下試劑：

逆轉(zhuǎn)錄酶 2 μL

Cy5-dCTP或Cy3-dCTP 3 μL

（4）用手指彈打管壁以混勻樣品，手浴2 min。將Eppendorf管置于42℃水浴2 h。

（5）依次在Eppendorf管中加入標(biāo)記試劑I 4 μL，65℃水浴10 min后加入標(biāo)記試劑II 4 μL。混勻，合并對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。避光，真空抽干至50 μL左右。

（6）使用DNA純化柱（或乙醇沉淀）純化DNA。

（7）將柱體在旋渦混合器上劇烈振蕩搖勻，懸浮內(nèi)溶的樹脂。將柱頂端的小帽旋松四分之一圈，掰斷柱下端的密封頭。

（8）將柱置于一個(gè)1.5 mL的Eppendorf管中，以3 000 rpm離心 1min將柱置于另一個(gè)新的1.5 mL Eppendorf管中，去掉頂端的帽，將樣品慢慢加到樹脂上表面的中間，注意不要攪動(dòng)柱體。以3 000 rpm離心2 min，經(jīng)純化的樣品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。

（9）加入標(biāo)記試劑III 8 μL，真空抽干。

3、雜交

（1）在抽干的探針管中加6.5 μL雜交試劑I，充分混勻，使探針溶解。再加入6.5 μL雜交試劑II，混勻備用。

（2）將預(yù)雜交的玻片取出，用ddH2O沖去蓋玻片。

（3）將探針置于95℃水浴中變性2 min；玻片置于95℃水浴中變性30 s，玻片取出浸無(wú)水乙醇30 s，探針取出后迅速置于冰上。

（4）將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42℃雜交箱內(nèi)雜交過(guò)夜(16～18 h)。

4、洗片

（1）用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，去除蓋玻片。

（2）準(zhǔn)備兩個(gè)染色缸，分別裝有0.5%的洗片試劑1+2%的洗片試劑2、5%的洗片試劑3，放入60℃水浴鍋中。

（3）將玻片依次浸入以上兩個(gè)染色缸中洗滌10 min。

（4）用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，晾干后掃描。

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1樓 2017-01-13 18:58:31

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lanfu

新蟲 (初入文壇)

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

老師您好，我沒有用過(guò)Cy3-dCTP ，想問(wèn)一下一般一管是多少體積的？或者一般25 nmoles有多少體積？

贊一下

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2樓2018-06-28 10:05:33

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