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免疫熒光染色
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細(xì)胞免疫熒光染色 1.材料準(zhǔn)備 1)蓋玻片.載玻片 蓋玻片 水洗 浸泡于75％的乙醇溶液 超聲波 泡酸 載玻片 水洗 無水乙醇浸泡 烘干 2）試劑 a.固定液: 4％甲醛， 4％多聚甲醛（PBS，72度溶解） b.透膜液：0.2％或0.3％triton X-100, 甲醇＋丙酮（V：V＝1：1） c.封閉液：5％BSA 以上試劑除甲醇＋丙酮外均用PBS配制 d.一抗：Rabit-anti-HA（1:500） ,Mouse-anti-myc（ 1:500）, Mouse-anti-flag（1:1500), e.二抗： Goat-anti-Rabbit FITC(1:500) , Goat-anti-Rabbit-Mouse Texas(1:500） 一抗二抗 均用封閉液稀釋 f. Hoechst 5ug/ml PBS稀釋 g. 90％甘油溶于PBS h . 指甲油 2. 蓋玻片處理 在細(xì)胞培養(yǎng)之前為了讓某些細(xì)胞（例如293，293T）的貼壁性能提高需對(duì)蓋玻片進(jìn)行處理，常用的處理方法有： A：凝膠（gelatin）處理： 1.配制2%的凝膠水溶液，高壓滅菌（同時(shí)也有助于凝膠的溶解） 2.將適量蓋玻片（一般不超過40片）放入10cm的細(xì)胞培養(yǎng)盤 3.加入10ml 2%的凝膠溶液放在脫色搖床上，在室溫下shake1小時(shí)。 4.將200ul的25％的異戊二醛加到10ml的新配制的1xPBS 5.吸去凝膠溶液，加入新配制的異戊二醛溶液，室溫下?lián)u15分鐘。 6.用PBS洗5次，每次5分鐘。 7.將蓋玻片放在30mm盤或者是六空板，UV照射1小時(shí)，備用。 B：多聚賴氨酸處理 1.將洗干靜的蓋玻片放在40 μg/ml多聚賴氨酸處理溶液中，室溫下浸泡大約1小時(shí) 2.自來水沖洗1小時(shí)，然后用蒸餾水浸泡3次，每次5分鐘。 3 UV照射3小時(shí)，備用。 3.細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)細(xì)胞的不同生長速度而調(diào)節(jié)分細(xì)胞時(shí)的密度，一般說來，在細(xì)胞固定前其密度達(dá)到1X106 為宜1X106 4.轉(zhuǎn)染 為了檢測(cè)某種蛋白分子的細(xì)胞內(nèi)定位或者觀察兩種蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)的共定位，常常將某基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，常用的有PEI，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等。 5.染色 1).轉(zhuǎn)染24hr后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗一次 2).固定： 4％甲醛或 4％多聚甲醛， 20min， PBS洗二次 3).透膜：a. 0.2％或0.3％triton X-100, RT，10min ,PBS洗二次 b.甲醇＋丙酮（V：V＝1：1）, -20 °, 20min, PBS洗三次 4).封閉：封閉液800ul， RT，60min （時(shí)間可以長些，4° ） 5).一抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗5次，5min/time 6).二抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗2次，5min/time 7).染核：Hoechst，200ul,10min, PBS洗4次，5min/time 8).封片：9ul 90％甘油. 不要留有氣泡。 6. 熒光顯微鏡觀察 |
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